汪強強賈偉章黃澤波，

（1. 武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430071；2. 廣東藥學(xué)院生物制藥研究所，廣州 510006）

烏鱧（Channa argus）MHC Class I 全長cDNA序列的克隆及表達(dá)特征

汪強強1賈偉章2黃澤波1，2

（1. 武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430071；2. 廣東藥學(xué)院生物制藥研究所，廣州 510006）

旨在探究烏鱧（Channa argus）MHC基因的分子特征、表達(dá)方式及多態(tài)性。應(yīng)用抑制差減雜交（SHH）和快速擴增cDNA末端（RACE）技術(shù)克隆并鑒定了烏鱧全長MHC I cDNA序列Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib，推測氨基酸序列與已知硬骨魚MHC I基因同源。Char-Ia-1和Char-Ia-2 cDNA序列包含1 167和1 083 bp的開放閱讀框，分別編碼388和360 aa的膜型Ⅰ類分子；而Char-Ib cDNA序列包含978 bp的開放閱讀框，編碼325 aa，顯著截短的羧基末端顯示Char-Ib為潛在的分泌型Ⅰ類分子。比較發(fā)現(xiàn)Char-Ia與Char-Ib在3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)存在顯著差異，在細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的氨基酸序列同源性均較低，推測二者來自不同的MHC I基因座。氨基酸序列比對顯示烏鱧MHC I分子與抗原肽結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基較保守，在α1和α3結(jié)構(gòu)域均出現(xiàn)硬骨魚特征性的氨基酸殘基缺失。進化樹分析表明Char-Ia-1和Char-Ia-2聚為一簇，與Char-Ib處于不同的進化分支上，進一步證實Char-Ia與Char-Ib分別由不同MHC I基因座編碼。RT-PCR分析顯示烏鱧MHC I在組織中呈現(xiàn)組成型表達(dá)。設(shè)計基因?qū)Ｒ恍砸餀z測烏鱧Char-Ia與Char-Ib兩類MHC I基因在組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Char-Ia以較低的濃度表達(dá)于所有被檢測組織，而Char-Ib主要表達(dá)于脾、腸、鰓和外周血，呈現(xiàn)明顯的組織表達(dá)特異性，提示兩類MHC I分子在魚類免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同的生理功能。

主要組織相容性復(fù)合物；基因座；表達(dá)特征；烏鱧

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）是染色體上緊密連鎖的基因群組成具有高度多態(tài)性的區(qū)域，其編碼產(chǎn)物在脊椎動物免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能［1］。自1990年Hashimoto等［2］首次克隆鯉（Cyprinus carpio）MHC基因以來，已對具有重要經(jīng)濟價值的魚類MHC基因及其多態(tài)性開展了廣泛研究，其中包括：鯉［3，4］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［5-7］、斑點叉尾鮰（Letalurus punetaus）［8］、真鯛（Chrysophrys major）［9，10］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［11，12］和海鱸（Dicentrarchus labrax）［13］等。MHC I類分子基因不僅具有高度的多態(tài)性，而且存在一定程度的剪切異構(gòu)現(xiàn)象。哺乳動物具有缺失跨膜區(qū)、α3結(jié)構(gòu)域及同時缺失α2和α3結(jié)構(gòu)域的不同MHC I剪切異構(gòu)體，可以形成膜型和分泌型等MHC I分子從而執(zhí)行不同生理功能［14，15］。選擇性剪切異構(gòu)體是豐富蛋白質(zhì)多樣性的重要途徑，免疫系統(tǒng)的選擇性剪切增加了免疫系統(tǒng)調(diào)控的復(fù)雜性和多樣性。魚類MHC基因的分子結(jié)構(gòu)、組成及多態(tài)性與哺乳動物MHC基因具有相似性，但是作為低等脊椎動物其MHC I類分子特征也存在一定的差異［16-18］。在硬骨魚大眼鱸（Stizostedion vitreum）克隆一類MHC I cDNA序列，由于二核苷酸序列重復(fù)破壞了跨膜區(qū)的疏水性產(chǎn)生潛在分泌型MHC I分子［19］，其在魚類免疫系統(tǒng)中的功能尚未明確。哺乳動物膜型和分泌型MHC I分子表達(dá)形式不同，其功能差異顯著［14］。硬骨魚MHC I基因在多數(shù)組織中均有表達(dá)，其中在腎臟、胸腺、脾、心臟和腸中表達(dá)較強，在腦、肝臟和肌肉中表達(dá)較弱［5，19］。然而，硬骨魚類膜型和分泌型MHC I類分子的表達(dá)特征及其生物學(xué)功能還有待進一步探索。因此，對魚類不同類型優(yōu)勢MHC I等位基因組成和功能進行研究，可為了解魚類免疫系統(tǒng)的組成和免疫應(yīng)答機制奠定基礎(chǔ)。

烏鱧（Channa argus）屬鱸形目（Perciformes）、鱧科（Channidae）、鱧屬（Channa），其肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)價值頗高，是我國較為重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，然而高密度集約化養(yǎng)殖引發(fā)的病害成為限制烏鱧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸［20］。本研究對烏鱧MHC I基因進行克隆和序列分析，檢測MHC I在烏鱧組織中的表達(dá)情況，并進一步分析Char-Ia和Char-Ib兩類MHC I基因在組織中表達(dá)的差異，旨在探究其MHC基因的分子特征、表達(dá)方式及多態(tài)性。

1 材料與方法

1.1 材料

烏鱧購買自湖北武漢水果湖水產(chǎn)市場，個體約250 g，實驗室控溫養(yǎng)殖一周。新鮮的組織材料放入液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 MHC I cDNA序列 取烏鱧新鮮頭腎組織材料100 mg，Trizol試劑盒提取組織總RNA（Invitrogen），mRNA純化試劑盒制備mRNA（Promega）。以poly I：C誘導(dǎo)烏鱧為Tester，對照為Driver，利用差減雜交技術(shù)構(gòu)建頭腎差減cDNA文庫（Clontech）。通過對文庫序列的篩選、克隆與測序，得到834 bp的cDNA序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對顯示其與已知MHC I基因同源。

1.2.2 RACE-PCR獲得MHC I基因全長 5'端RACE擴增，按BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit合成全長cDNA（Clontech）。引物設(shè)計，見表1。RACE-PCR使用熱啟動和降落PCR程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s（每輪循環(huán)降1℃），72℃延伸1 min，10個循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán)；72℃延伸6 min。第二輪巢式PCR使用5' nested primer和MHC-I-R2，以1 μL第一輪PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR反應(yīng)。5' RACE測序結(jié)果顯示，獲得顯著差異的MHC I cDNA序列，在開放閱讀框起始位置分別設(shè)計引物MHC-Ia-F和 MHC-Ib-F。使用接頭引物3' Adapter與基因特異性引物MHC-Ia-F和 MHCIb-F分別擴增MHC I基因3'末端，循環(huán)原理：94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2 min；72℃延伸6 min。

表1 烏鱧MHC I基因克隆與表達(dá)引物

1.2.3 克隆、測序及序列比對分析 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段切膠回收（Omega）。純化后PCR產(chǎn)物與pMD18-T 載體（TaKaRa）相連接，轉(zhuǎn)化制備的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑選單克隆進行菌落PCR鑒定，陽性克隆測序。通 過NCBI網(wǎng) 站（http：//www.ncbi.nlm.nib.gov/blast）BLAST程序進行序列相似性比對，ExPASy網(wǎng)站（http：//au.expasy.org）翻譯軟件獲得氨基酸序列。由Cluatal W 1.8程序完成氨基酸序列的同源性比較分析，并通過MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 MHC I 組織表達(dá)分析 取烏鱧頭腎、后腎、腸、肌肉、心臟、脾、肝臟、腦、鰓和外周血等組織材料，液氮研磨，提取組織總RNA，經(jīng)過DNase I 消化（TaKaRa）后，使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA一鏈（TaKaRa）。設(shè)計3對特異性引物MHC-I-TF/TR、MHC-Ia-F/MHC-I-R2和 MHC-Ib-F/MHC-I-R2分別擴增203 bp MHC I、648 bp Char-Ia和651 bp Char-Ib。選擇β-actin為內(nèi)參。用上述4對引物分別進行PCR反應(yīng)：94℃ 2 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃Char-Ia 和 Char-Ib延伸1 min，MHC I和 β-actin延伸30 s，26個循環(huán)；最后72℃ 6 min。

2 結(jié)果

2.1 MHC I基因克隆

根據(jù)篩選獲得的MHC I cDNA序列，通過基因?qū)Ｒ恍砸锛敖宇^引物進行5' 端RACE-PCR和3'端 RACE-PCR，3條全長MHC I cDNA序列（Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib）被分別克隆、鑒定（Gen-Bank登錄號：EU864508、EU864509和EU864510）。Char-Ia-1 cDNA全長為1 826 bp，包含1 167 bp的開放閱讀框，編碼388 aa。3' 端非編碼區(qū)具有多個mRNA不穩(wěn)定信號（ATTTA）和一個加尾信號（AATAAA）。Char-Ia-2 cDNA全長為1 868 bp，包含1 083 bp的開放閱讀框，編碼360 aa。3' 非編碼區(qū)存在6個mRNA不穩(wěn)定信號和一個加尾信號。分子特征表明Char-Ia-1和Char-Ia-2編碼MHC I 包含跨膜去，是一類膜型MHC I分子。Char-Ib cDNA全長為1 179 bp，包含978 bp的開放閱讀框，編碼325 aa，顯著截短的羧基末端顯示Char-Ib為潛在的分泌型Ⅰ類分子。

2.2 MHC I蛋白質(zhì)序列分析

圖1 烏鱧Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib與其他脊椎動物MHC I基因編碼的氨基酸序列比較

根據(jù)MHC I cDNA 全長序列及由此推測的蛋白質(zhì)序列，烏鱧MHC I 蛋白質(zhì)序列與已知同源的蛋白質(zhì)均具有較高的相似性，在多個位點均具有保守的氨基酸殘基（圖1）。一個潛在的N糖基化位點位于胞外結(jié)構(gòu)域α1區(qū)，參與二硫鍵形成的4個保守半胱氨酸分布于胞外結(jié)構(gòu)域α2和α3。Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib推測的氨基酸序列均具有保守的多肽結(jié)合區(qū)和B2m結(jié)合位點。雖然硬骨魚類位于胞外結(jié)構(gòu)域α3區(qū)的CD8作用位點不完全保守，但是Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib CD8作用位點富含酸性氨基酸，其中8個氨基酸中有4個為酸性氨基酸。與HLA-A氨基酸序列相比，烏鱧與其他硬骨魚MHC I在α1（54-55）區(qū)和α3（189-190）存在明顯的氨基酸序列缺失。Char-Ia-1與Char-Ia-2的氨基酸相似性75%，但是Char-Ia-1和Char-Ia-2具有完全不同的細(xì)胞質(zhì)區(qū)。Char-Ib與Char-Ia-1和Char-Ia-2的相似性較低，其中羧基末端差異顯著。

系統(tǒng)進化樹分析（圖2）顯示，Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib處于進化樹上不同的分支。Char-Ia-1和Char-Ia-2集成一簇，其親緣關(guān)系較近。Char-Ib單獨形成一個進化分支，與Char-Ia-1和Char-Ia-2關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 脊椎動物MHC I氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.3 MHC I組織表達(dá)分析

RT-PCR檢測烏鱧MHC I mRNA在頭腎、后腎、腸、肌肉、心臟、脾、肝臟、腦、鰓和外周血組織中的表達(dá)水平。結(jié)果（圖3）顯示，烏鱧MHC I組成型表達(dá)于所有組織中，Char-Ia則以較低的濃度表達(dá)于所有組織，而Char-Ib主要表達(dá)于脾、腸、鰓和外周血，呈現(xiàn)明顯的組織表達(dá)特異性。

圖3 烏鱧MHC I在組織中的表達(dá)情況

3 討論

應(yīng)用抑制差減雜交（SHH）和快速擴增cDNA末端（RACE）技術(shù)克隆并鑒定了烏鱧3條全長MHC I cDNA 序列Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib，編碼的MHC I分子均包括導(dǎo)肽、胞外結(jié)構(gòu)域（α1、α2和α3）、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)。Char-Ia-1和Char-Ia-2在α1結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)高度的序列相似性，然而在跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的顯著差異表明二者應(yīng)來源于MHC I基因的重組［17］。Char-Ia和Char-Ib在3' UTR呈現(xiàn)較小的序列相似性，在胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)同源性均較低；系統(tǒng)進化樹分析顯示Char-Ia-1和Char-Ia-2聚為一類，與Char-Ib處于不同的進化分支上，因此當(dāng)前的數(shù)據(jù)支持Char-Ia和Char-Ib分別由不同MHC I基因座編碼。氨基酸序列比對顯示烏鱧MHC I分子與抗原肽結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基較保守，與其他硬骨魚MHC I分子一樣在α1和α3結(jié)構(gòu)域均出現(xiàn)明顯的氨基酸殘基缺失［19］。MHC I細(xì)胞質(zhì)區(qū)存在絲氨酸磷酸化位點［4］，然而烏鱧Char-Ia-1和Char-Ia-2編碼MHC I的細(xì)胞質(zhì)區(qū)分別包含4個和9個絲氨酸殘基，氨基酸序列的相似性尚不能確定發(fā)揮磷酸化作用的絲氨酸殘基。與Char-Ia-1和Char-Ia-2相比，Char-Ib具有較短的跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)，顯著截短的羧基末端推測Char-Ib為一類潛在的分泌型MHC I分子。在大眼鱸中發(fā)現(xiàn)由于二核苷酸序列多次重復(fù)插入MHC I α3 結(jié)構(gòu)域末端，破壞了跨膜區(qū)閱讀框從而產(chǎn)生分泌型MHC I分子［19］。雖然烏鱧Char-Ib多肽的羧基末端存在3個絲氨酸殘基，然而分泌型與膜型MHC I分子的絲氨酸殘基可能執(zhí)行不同的生理功能。

對虹鱒和大眼獅鱸的Northern blot檢測結(jié)果顯示，MHC I基因主要表達(dá)于腎臟、胸腺、脾、心臟和腸［5，19］。通過半定量RT-PCR檢測顯示烏鱧MHC I基因組成型表達(dá)于被檢測組織，其中在腸、鰓和心臟的表達(dá)量略高。值得注意的是Char-Ia和Char-Ib在檢測組織中的表達(dá)水平存在顯著差異。Char-Ia以較低的濃度表達(dá)于所有被檢測組織，而Char-Ib主要表達(dá)于脾、腸、鰓和外周血，提示Char-Ib的表達(dá)具有組織特異性。在硬骨魚類，檢測斑點叉尾鮰MHC I基因也發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的現(xiàn)象［8］。哺乳類H-2 mRNA在肝臟限制性表達(dá)，其翻譯的MHC I分子僅具有細(xì)胞外區(qū)域，推測為一類分泌型MHC I分子［21，22］。組織特異性表達(dá)與蛋白質(zhì)序列特征表明烏鱧Char-Ib編碼多肽具備分泌型MHC I分子特征。這類MHC分子在調(diào)控T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞相互作用以及控制自然殺傷細(xì)胞的功能中發(fā)揮重要作用［15，22］。烏鱧MHC I的克隆與表達(dá)研究有助于探討魚類MHC I基因的多態(tài)性。

4 結(jié)論

利用RACE 技術(shù)從烏鱧中克隆并鑒定了MHC I cDNA序列Char-Ia-1、Char-Ia-2和Char-Ib，并對蛋白質(zhì)序列進行了詳細(xì)的位點分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測。其中，Char-Ib 具有顯著截短的羧基末端呈現(xiàn)分泌型MHC I類分子特征。進化樹分析表明Char-Ia與Char-Ib處于不同的進化分支上，應(yīng)由不同MHC I基因座編碼。RT-PCR分析顯示Char-Ia與Char-Ib組織表達(dá)差異顯著，提示兩類MHC I分子在魚類免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同的生理作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Cloning and Expression Characteristics of A Full-length cDNA of MHC I from Snakehead Channa argus

Wang Qiangqiang1Jia Weizhang2Huang Zebo1，2
（1. School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430071；2. Institute of Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006）

By the methods of suppression subtractive hybridization（SSH）and rapid amplification of cDNA ends（RACE）， 3 fulllength sequences， Char-Ia-1， Char-Ia-2 and Char-Ib of major histocompatibility complex（MHC）I from snakehead（Channa argus）were cloned and characterized. The sequences of these clones were predicted to be in a high degree of homology with known teleost’s MHC I. Char-Ia-1 and Char-Ia-2 contained an open reading frame（ORF）of 1 167 and 1 083 bp， and encoded a putative peptide of 388 and 360 amino acid respectively. However， the cDNA of Char-Ib contained an ORF of 978 bp encoding putative peptide of 325 amino acid， and a significantly shorter carboxyl terminal indicated that it was a molecule of secreting type I. Comparing Char-Ia and Char-Ib demonstrated significant difference in 3' untranslated region， and low homology of amino acid’s sequences in extracellular domains， transmembrane and cytoplasmic regions. These suggested that Char-Ia and Char-Ib were encoded by two different loci. Alignment of amino acid sequence indicated that key antigenic peptideanchoring residues binding with snakehead’s MHC I were conserved， and there was amino acid deletion in α1 and α3 domains as the same characteristics of teleost. A phylogenetic analysis indicated that Char-Ia-1 and Char-Ia-2 branched together in the tree， and away from Char-Ib， this further demonstrated that they were from two different loci. RT-PCR analysis showed that snakehead MHC I gene was constitutivelyexpressed in all detected tissues. Moreover， we designed specific primers to determine the expression level of Char-Ia and Char-Ib. The results illustrated that Char-Ia was ubiquitously expressed at low level， whereas the Char-Ib was predominantly expressed in spleen， intestine， gill and peripheral blood， suggesting the significant specificity of expression in tissue， which indicated that Char-Ia and Char-Ib played the different physiological functions in the immune responses of fish.

major histocompatibility complex；loci；expression characteristics；snakehead Channa argus

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.024

2015-03-23

國家自然科學(xué)基金項目（30371091）

汪強強，男，碩士，研究方向：魚類分子免疫學(xué)；E-mail：wqq@whu.edu.cn

賈偉章，男，副教授，研究方向：水生動物免疫學(xué)；E-mail：jiawzh@gdpu.edu.cn