袁源 陳亞瓊

（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營養(yǎng)科學(xué)研究所，上海 200031）

視黃酸刺激RARE調(diào)控?zé)晒馑孛笀蟾婊虮磉_(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用

袁源 陳亞瓊

（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營養(yǎng)科學(xué)研究所，上海 200031）

類維生素A，通過視黃酸（retinoic acid，RA）代謝旺盛組織的靶基因調(diào)控，與生物節(jié)律通路相互作用，在代謝性疾病發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在293T及小鼠肝原代細(xì)胞中，構(gòu)建視黃酸反應(yīng)元件（RARE）調(diào)控的熒光素酶報告基因表達(dá)系統(tǒng)，為研究類維生素A與節(jié)律和代謝研究中靶基因上游調(diào)控信號分子提供可能。用定點(diǎn)突變PCR方法在pGL3-Basic載體中插入RARE片段，檢測報告基因表達(dá)及RARE對視黃酸響應(yīng)的半數(shù)有效濃度（EC50），初步篩選可能調(diào)控RARE的靶基因，通過酶切連接將熒光素酶報告基因Luciferase和啟動子RARE片段構(gòu)入穿梭載體pShuttle，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BJ518獲得重組腺病毒載體Ad-Basic-RARE-Luc，轉(zhuǎn)染MGH細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，在小鼠肝原代細(xì)胞檢測腺病毒活性。結(jié)果顯示，構(gòu)建的RARE調(diào)控的熒光素酶報告基因表達(dá)載體在293T細(xì)胞可被RA刺激，RARβ促進(jìn)RA刺激RARE表達(dá)，而CRY1抑制RARE-Luc對RA的響應(yīng)，并成功構(gòu)建了在小鼠肝原代細(xì)胞響應(yīng)RA刺激的Adeasy-Basic-RARE-Luc腺病毒載體。

視黃酸；RARE；熒光素酶報告基因；節(jié)律；代謝

類維生素A，包括視黃醇及其衍生物［1］，調(diào)控著細(xì)胞的分化、增殖與凋亡［2］。近年來研究表明，在代謝性疾病發(fā)展過程中，類維生素A發(fā)揮著重要作用。類維生素A通過調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)哺乳動物的糖脂代謝，被認(rèn)為是糖尿病，肥胖等重要的治療靶點(diǎn)。報道稱RA過量會引起小鼠體重減輕，白色脂肪減少［3，4］，改善小鼠胰島素敏感性［4］。有研究表明維生素A還影響著生物鐘和節(jié)律，尤其是視黃酸（retinoid acid，RA）信號通路與生物鐘信號通路相互調(diào)節(jié)［5］。肝臟是維生素A主要的吸收代謝場所，同時也高表達(dá)節(jié)律基因參與機(jī)體生物鐘調(diào)節(jié)，此外在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)RARα，其轉(zhuǎn)錄mRNA水平呈周期性變化，有力證明了RA影響中樞生物鐘［6］。越來越多的證據(jù)表明生物節(jié)律紊亂和糖尿病肥胖等代謝性疾病有著重要關(guān)系，如CRY1節(jié)律基因過表達(dá)可以降低血糖以及改善db糖尿病老鼠胰島素敏感性［7］。RA作為維生素A中最主要的具有轉(zhuǎn)錄活性的組分，通過與視黃酸受體（Retinoic acid receptors，RARs）和類視黃醇X受體（Retinoid X receptors，RXRs）結(jié)合［8］，調(diào)控超過500種基因的表達(dá)。眾多功能各異的維生素A靶基因的啟動子序列中均含有兩個重復(fù)的PuG（G/T）TCA的位置［9］，即視黃酸反應(yīng)原件（RARE）。RARs和RXRs形成的異源二聚體可以結(jié)合到RARE上，調(diào)控靶蛋白的轉(zhuǎn)錄。類維生素A對代謝的調(diào)控主要是通過RA代謝旺盛組織的基因調(diào)控實現(xiàn)的，但其具體的的分子機(jī)制還不清楚。因此研究肝臟類維生素A對節(jié)律調(diào)控以及代謝的信號通路具有深遠(yuǎn)意義，而RA對其靶基因調(diào)控的分子機(jī)制是一個重要方向，RARE可能可以作為研究類維生素A與靶基因調(diào)控的重要位點(diǎn)。本研究通過構(gòu)建RARE元件調(diào)控的熒光素酶報告基因表達(dá)系統(tǒng)，更直接高效地篩選出影響RARELuc對RA響應(yīng)敏感性的基因，并構(gòu)建在小鼠肝原代細(xì)胞表達(dá)的RARE-Luc腺病毒表達(dá)載體，更好地模擬小鼠體內(nèi)信號通路，旨在為進(jìn)一步探尋RA調(diào)控代謝靶基因的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGL3-Basic熒光素酶報告基因質(zhì)粒及pShuttle穿梭載體質(zhì)粒購于Promega，大腸桿菌XL-1 Blue及BJ 5183為本實驗室保存，人胚胎腎細(xì)胞株293T及MGH細(xì)胞由本實驗室保存，C57正常小鼠購自南京模式動物研究所。Kpn I-HF、Sal I-HF及T4連接酶購自NEB公司，Cutsmart酶切緩沖液（BioLabs）、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM（GIBCO）、胎牛血清（Hyclone）、胰蛋白酶Trypsin、M199 和HBSS緩沖液購自Invitrogen，HEPES、臺盼藍(lán)染液和膠原酶購自Sigma，DNA ladder marker V、6×loading buffer 及2×Taq Master Mix購自萊楓DNA 膠回收試劑盒（Bio Dev-Tech），Prime Star HS DNA Polymerase和 5×PS buffer 來自TaKaRa。熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)（Thermo Scientific），Master Flex蠕動泵（Cole-Parmer Instrument Company）。

1.2 方法

1.2.1 定點(diǎn)突變PCR 根據(jù)GenBank提供的RARE序列，參照pGL3-Basic-Luc序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，用Primer5軟件設(shè)計一段完全互補(bǔ)的引物序列。所用引物由上海桑尼生物科技公司合成。正向引物：TAT CGA TAG GTA CCG AGC TCG CGA GTT CAG CAA GAG TTC AGC CGG CGA GTT CAG CAA GAG TTC AGC CGG GGC TCG AGA TCT GCG ATC，反向引物：AGA TCG CAG ATC TCG AGC CCC GGC TGA ACT CTT GCT GAA CTC GCC GGC TGA ACT CTT GCT GAA CTC GCG AGC TCG GTA CCT ATC GAT。

取10 ng pGL3-Basic質(zhì)粒，用PrimerStar試劑盒進(jìn)行20 μL體系PCR反應(yīng)：93℃ 3 min，93℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 4 min，22個循環(huán)，72℃ 5 min，最后4℃保存。取PCR反應(yīng)前后樣品通過1%瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定長度，分別在4 600 bp和4 800 bp左右。將PCR產(chǎn)物用Dpn I在37℃ 酶切2 h，將酶切后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板：將XL-1 Blue感受態(tài)從-80℃取出，放置冰上10 min，加入 Dpn I酶切產(chǎn)物再在冰上靜置15 min，在42℃水浴鍋熱擊1 min，然后放回冰上10 min，取300 μL 含Kam的LB液體培養(yǎng)基，在37℃ 搖床培養(yǎng)30 min，涂含有Kam抗生素LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑單克隆測序。

1.2.2 pGL3-Basic-RARE-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和報告基因檢測 將培養(yǎng)的293T細(xì)胞用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約18 h后，細(xì)胞長到80%左右，用脂質(zhì)體瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞的方法，通過PEI介導(dǎo)，每個孔共轉(zhuǎn)染50 ng pGL3-Basic-RARE-Luc 和25 ng 內(nèi)參質(zhì)粒pRSV-Renilla，6 h后換液加入RA（1 μmol/L），18 h后去掉培養(yǎng)基，用熒光素酶報告基因裂解緩沖液裂解細(xì)胞，靜置10 min后，取上清分別檢測Luc和Renilla報告基因表達(dá)：50 μL 裂解液加50 μL報告基因顯色液。用Renilla報告基因的表達(dá)量對Luc進(jìn)行校正，以Luc/Renilla比值作為最終的報告基因活性。

1.2.3 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-Basic-RARE-Luc的構(gòu)建 取測序正確的pGL3-Basic-RARE-Luc和pShuttle質(zhì)粒，用Kpn I-HF和Sal I-HF進(jìn)行雙酶切，40 μL反應(yīng)體系如下：pGL3-Basic-2RARE-Luc和pShuttle質(zhì)粒各500 ng，用ddH2O補(bǔ)平至33.2 μL，Cutsmart酶切緩沖液4 μL，BSA 0.4 μL，Kpn I-HF和Sal I-HF各1.2 μL。37℃培養(yǎng)箱酶切5 h，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，根據(jù)預(yù)估目的片段大小，切膠并用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。測定回收DNA濃度，按照如下體系進(jìn)行連接：10 ng pShuttle酶切產(chǎn)物，2 μL T4 ligasion buffer，1 μL T4連接酶，實驗組加入pGL3-Basic-RARE-Luc酶切產(chǎn)物補(bǔ)平至20 μL，對照組則加入等體積的ddH2O至20 μL室溫連接過夜。連接產(chǎn)物取10 μL用于轉(zhuǎn)化XL-1 Blue感受態(tài)（轉(zhuǎn)化步驟同前），涂含有Kam抗生素LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑單克隆送上海博尚測序公司測序。

1.2.4 重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc的構(gòu)建 取測序正確pShuttle-Basic-RARE-Luc質(zhì)粒10 μg用Pme1酶切：cutsmart buffer 44 μL，BSA 0.4 μL，Pme I μL。37℃恒溫培養(yǎng)箱酶切5 h。酶切產(chǎn)物用DNA膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化，用50 μL ddH2O洗脫，取一半用于轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)（同XL-1 Blue轉(zhuǎn)化步驟，37℃搖床活化30 min，涂Kam LB 平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取單克?。?。用質(zhì)粒小抽試劑盒提取質(zhì)粒，用50 μL ddH2O洗脫，取30 μL用PacI酶切鑒定：30 μL洗脫的質(zhì)粒，buffer I 4 μL，BSA 0.4 μL，Pac I 0.7 μL ddH2O補(bǔ)平到40 μL。37℃酶切5 h后，用0.8%瓊脂糖凝膠鑒定，如果酶切產(chǎn)物有30 kb左右和4.5 kb（或3 kb）兩條片段，則認(rèn)為Adeasy-Basic-RARE-Luc重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，可轉(zhuǎn)XL-1 Blue，搖菌并中抽質(zhì)粒，可用于包裝腺病毒。

1.2.5 腺病毒包裝與擴(kuò)增 取60 μg重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc在30 μL Buffer I，15 μL BSA和15 μL Pac I體系酶切4 h，酶切產(chǎn)物用DNA回收純化試劑盒純化，最后用50 μL ddH2O洗脫。在長到80%左右的10 cm MGH培養(yǎng)皿中加入純化過的酶切產(chǎn)物，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-2周，等細(xì)胞幾乎全部漂起，收培養(yǎng)基得到第一代包裝成功的腺病毒。選取活力較好，可在傳代后3 d內(nèi)長滿的MGH細(xì)胞，在MGH 長滿的15 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入包裝成功的第一代腺病毒。等待細(xì)胞全部漂起后，收取培養(yǎng)基，加入到6個長滿的MGH 15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，等待細(xì)胞全部漂起，收獲的培養(yǎng)基再感染30個長滿的MGH 15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，收獲全部漂起的細(xì)胞，6 000 r/min 離心8 min，離心下來的細(xì)胞沉淀用10 mL PBS重懸，補(bǔ)足到20 mL，在液氮中凍融3次，每次10 min，儲存在-80℃。把上清收集到一個新的廣口瓶，按照242.3 g/L加入硫酸銨，在室溫攪拌2 h，6 000 r/min離心6 min，去掉上清，沉淀用10 mL PBS重懸，補(bǔ)足到20 mL，儲存在-80℃。

1.2.6 原代肝細(xì)胞分離與重組腺病毒活力檢測 準(zhǔn)備肝原代分離所需的緩沖液：沖洗緩沖液（HBSS+50 mmol/L HEPES+5 mmol/L EGTA）， 消 化 緩 沖 液（HBSS+50 mmol/L HEPES+5 mmol/L EGTA+5 mmol/L CaCl2+30 mmol/L膠原酶），預(yù)熱到37℃。選取正常C57小鼠，稱重，按照6 μL/g體重腹腔注射10%水合氯醛。等老鼠麻醉后，打開老鼠腹腔，將針管刺入肝門靜脈，打開蠕動泵，灌流沖洗緩沖液把血沖干凈，換消化緩沖液灌流。關(guān)掉蠕動泵，把整個肝臟組織剪下來，放入沖洗緩沖液中，在超凈臺用鑷子和剪刀把細(xì)胞刮下來，用250 μmol/L尼龍濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，濾液600 r/min 離心2 min。去掉上清，加入無血清的M199培養(yǎng)基重懸混勻，600 r/min 離心3 min，去掉上清，用30 mL含有10% FBS的M199培養(yǎng)基重懸混勻，取100 μL重懸液與100 μL臺盼藍(lán)染液混勻涂板計數(shù)，按照每個孔20萬細(xì)胞種在已經(jīng)包被好的24孔板。37℃培養(yǎng)4 h后，去掉培養(yǎng)基，換成無血清M199培養(yǎng)基，在實驗組加入重組腺病毒，對照組加入GFP腺病毒，培養(yǎng)過夜。第2天換液加入RA 1 μmol/L，2 h后去掉上清，裂解細(xì)胞，檢測熒光素酶報告基因表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 pGL3-Basic-RARE-Luc的活性鑒定

將測序正確的定點(diǎn)PCR突變產(chǎn)物pGL3-Basic-RARE-Luc在293T細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)，以RSV-Renillla作為對照，6 h后加入RA，18 h后檢測報告基因的表達(dá)，結(jié)果（圖1）顯示，用Renilla檢測值校正后，pGL3-Basic-RARE-Luc的報告基因活性明顯高于空白對照，相對活性約為1.4（Luc/Renilla），具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明pGL3-Basic-RARE-Luc能在293T細(xì)胞中正常表達(dá)。加入RA后，表達(dá)活性增強(qiáng)4倍左右，RA能促進(jìn)pGL3-Basic-RARE-Luc報告基因的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 pGL3-Basic-RARE-Luc在293T中報告基因活性檢測及對RA的響應(yīng)

2.2 pGL3-Basic-RARE-Luc對RA的響應(yīng)受RARβ和CRY1調(diào)控

在293T細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)pGL3-Basic-RARE-Luc，同時過表達(dá)RARβ，以RSV-Renillla作為對照，6 h后加入RA，從10 μmol/L依次10倍稀釋，設(shè)置8個濃度梯度，18 h后檢測報告基因的表達(dá)，繪制曲線求得EC50。結(jié)果（圖2-A）顯示RARβ過表達(dá)后，pGL3-Basic-RARE-Luc對RA響應(yīng)的EC50值從53 μmol/L降低到93 nmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明RARβ增強(qiáng)RARE-Luc對RA刺激響應(yīng)的敏感性。以RARβ作為陽性對照，β-Gal作為空白對照，在293T細(xì)胞中過表達(dá)HA-CRY1，檢測RA刺激（1 μmol/L）下RARE-Luc報告基因表達(dá)，結(jié)果（圖2-B）顯示與對照組比，RA顯著促進(jìn)RARE-Luc的表達(dá)，約為對照的2-3倍；與β-Gal空白對照相比，RARβ增強(qiáng)RARE-Luc對RA刺激的響應(yīng)，而HA-CRY1下調(diào)RA促進(jìn)的RARE-Luc的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 RARβ和CRY1調(diào)控 RARE-Luc在293T細(xì)胞對RA的響應(yīng)

2.3 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-Basic-RARE-Luc的構(gòu)建

對載體pShuttle和構(gòu)建正確的pGL3-Basic-RARE-Luc用Kpn I-HF和Sal I-HF進(jìn)行雙酶切，以酶切前質(zhì)粒作為對照，用瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測。載體pShuttle雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖3），與酶切前對比，在6 000 bp左右有一條清晰的帶，與理論值相符，pGL3-Basic-RARE-Luc酶切前條帶在靠近5 500 bp處，雙酶切后產(chǎn)物顯示有兩條清晰的條帶，分別在3 500 bp和2 500 bp，2 500 bp和1 500 bp之間，RARE-Luc酶切片段理論值應(yīng)該在1 700 bp左右，即靠下面的一條（1 500 bp和2 500 bp之間）。切下來正確的片段用于膠回收以及后續(xù)的連接反應(yīng)，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-Basic-RARE-Luc。

圖3 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-Basic-2RARE-Luc構(gòu)建中載體和插入片段雙酶切圖

2.4 重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc的酶切鑒定

重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc陽性克隆鑒定。首先將測序鑒定正確的pShuttle-Basic-RARE-Luc用Pme I酶切后轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)，涂含Kam的平板，挑取陽性克隆搖菌培養(yǎng)，小抽提取質(zhì)粒，用Pac I酶切后的產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。結(jié)果（圖4）顯示有兩條清晰條帶，和Adeasy空載體酶切產(chǎn)物比較，分別在大于5 500 bp，以及3 500 bp和2 500 bp之間，和理論值30 kb和3 kb符合，酶切鑒定結(jié)果為陽性。

圖4 重組腺病毒Adeasy-Basic-RARE-Luc用Pac I酶切鑒定圖

2.5 RA促進(jìn)腺病毒Adeasy-Basic-RARE-Luc在肝原代細(xì)胞表達(dá)

在肝原代細(xì)胞中感染Adeasy-Basic-RARE-Luc重組腺病毒顆粒，饑餓過夜后加入RA刺激，1 h后檢測熒光素酶報告基因表達(dá)活性，結(jié)果（圖5）顯示，加入腺病毒感染后，肝原代細(xì)胞中報告基因信號明顯被啟動，Luciferase報告基因信號強(qiáng)度約為空白對照的3倍左右，加入RA刺激，可以增強(qiáng)報告基因的表達(dá)，信號強(qiáng)度為刺激前的2倍左右，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

圖5 重組腺病毒在肝原代細(xì)胞中表達(dá)活性檢測及對RA的響應(yīng)

3 討論

類維生素A（以下簡稱維生素A）既指食物中存在的天然物質(zhì)，又包含人工合成的化學(xué)藥劑。研究表明 VA缺乏飲食的大鼠在食物攝入量差異不大的情況下，丙糖肝糖異生能力下降，肝糖原消耗增加［10］，飲食攝入的維生素A和胡蘿卜素與NAFLD的發(fā)展負(fù)相關(guān)［11-13］，目前關(guān)于維生素A缺乏對肝臟脂肪代謝的影響還沒有定論。McGrane等［14］發(fā)現(xiàn)在維生素A缺失飲食的小鼠，其肝臟線粒體和脂肪酸氧化相關(guān)基因表達(dá)量下降，并發(fā)展為脂肪肝。但Oliveros的研究發(fā)現(xiàn)在維生素A缺失引起大鼠肝臟脂肪酸合成減少，線粒體脂肪酸氧化增強(qiáng)［15］。由于在動物模型上維生素A缺乏研究結(jié)果不一致，在基因水平上維生素A相關(guān)蛋白研究成為一個新的熱門方向，有研究表明通過肝細(xì)胞中表達(dá)負(fù)顯性RARα的轉(zhuǎn)基因小鼠能抑制肝臟中維生素A信號通路［16］，以及利用RAR信號通路的激動劑，通過小鼠腹腔注射atRA建立維生素A過量模型，脂肪酸合成及肝臟甘油三酯量均下降［17］。目前關(guān)于維生素A信號通路還沒有深入報道，由于小鼠模型的復(fù)雜性及其耗費(fèi)大量的時間和資源，如果能在已有研究提示的基礎(chǔ)上，建立一個體外的研究模型，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)的靈敏性，可以更直觀深入的研究維生素A相關(guān)基因作用。類維生素A中最具有轉(zhuǎn)錄活性的視黃酸（RA），通過與RARs/RXRs異源二聚體及RARE結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。RARE序列位于眾多類維生素A靶基因的啟動子中，含有兩個重復(fù)的PuG（G/T）TCA的位置。類維生素A主要通過RA代謝旺盛組織的基因調(diào)控，在肥胖和糖尿病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，成為一個重要的治療靶點(diǎn)。因此以RARE作為類維生素A調(diào)節(jié)代謝與節(jié)律信號通路的關(guān)鍵位點(diǎn)，來尋找可能的調(diào)控基因，對于研究RA及其信號通路調(diào)控的具體分子機(jī)制，深入探討維生素A在肝臟節(jié)律與代謝調(diào)節(jié)中的作用，具有重要的臨床意義。本研究采用定點(diǎn)突變PCR的方法，在pGL3-Basic的質(zhì)粒中插入RARE序列，用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)鑒定重組質(zhì)粒pGL3-RARE-Luc在293T表達(dá)活性及對RA的響應(yīng)，建立由RA刺激RARE調(diào)控?zé)晒馑孛笀蟾婊虻谋磉_(dá)系統(tǒng)，與已有的小鼠模型相比，可以簡便高效地篩選影響RA對RARE調(diào)控作用的基因，更直接地研究其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究維生素A及其通路在代謝中的作用提供體外細(xì)胞篩選模型。

RA是生物節(jié)律調(diào)控因子，其信號通路中的許多基因具有節(jié)律震蕩，與節(jié)律通路互相調(diào)控。在節(jié)律通路中，BMAL1和CLOCK結(jié)合促進(jìn)CRY/PER的轉(zhuǎn)錄，而CRY和PER上調(diào)后又抑制BMAL1/CLOCK，形成一個基于Ebox生物鐘反饋調(diào)節(jié)通路［18］。研究發(fā)現(xiàn)RARα與RARβ啟動子含有Ebox位點(diǎn)［19］，而且RA促進(jìn)RARα/RXRα二聚體與BMAL競爭性和CLOCK結(jié)合，抑制BMAL/CLOCK轉(zhuǎn)錄活性［20］。此外發(fā)現(xiàn)在PER1/BMAL啟動子中含有RARE序列［21］，提示RA與節(jié)律通路的相互調(diào)節(jié)。本研究利用已經(jīng)構(gòu)建的RA刺激熒光素酶報告基因載體，在293T分別過表達(dá)CRY1和RARβ，檢測RARE-Luc對RA響應(yīng)信號的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RARβ可以增強(qiáng)RARELuc對RA的響應(yīng)，而CRY1則抑制RA刺激 RARELuc的表達(dá)。揭示了CRY1可能通過RARE啟動子對RA下游靶基因的調(diào)控作用，進(jìn)而提示節(jié)律通路與RA互相作用，并為研究其具體作用機(jī)制提供一個新的突破點(diǎn)，具體靶基因的篩選待后續(xù)研究。

為了更好地模擬肝臟中RA調(diào)控通路，用已構(gòu) 建 的pGL3-Basic-RARE-Luc把RARE序 列 及Luciferase報告基因構(gòu)建到pShuttle穿梭質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌感受態(tài)中，成功構(gòu)建重組腺病毒載體Adeasy-Basic-RARE-Luc，在小鼠肝原代細(xì)胞中響應(yīng)RA刺激，可用于更好地在體內(nèi)研究CRY1及其他可能的調(diào)控因子與RA信號通路調(diào)控的機(jī)制，更深入闡釋維生素A代謝紊亂與肥胖糖尿病等疾病的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究利用定點(diǎn)突變PCR方法構(gòu)建了RARE啟動子調(diào)控的熒光素酶報告基因載體，在293T細(xì)胞中，RA刺激RARE-Luc表達(dá)，RARβ增強(qiáng)RA刺激RARE-Luc表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CRY1抑制RARE-Luc對RA的響應(yīng)，并利用pGL3-Basic-RARE-Luc載體，進(jìn)一步成功構(gòu)建出在肝原代被RA刺激表達(dá)的Adeasy-Basic-RARE-Luc的腺病毒載體。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction and Application of RARE-regulated Luciferase Reporter Gene System Stimulated by Retinoid Acid

Yuan Yuan Chen Yaqiong
（Institute for Nutritional Science，Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Science，Shanghai 200031）

Biostearin plays a crucial role in the development of metabolic diseases by target gene regulation of retinoic acid（RA）in metabolically active tissues and interaction with circadian pathway. The luciferase reporter gene system regulated by retinoic acid response element（RARE）was constructed and expressed in 293T and primary hepatocyte of a mouse， which provides the possibility for studying biostearin and circadian， as well as signaling molecules of upstream regulation of target genes in researching metabolism. By PCR-based sitespecific mutagenesis， RARE promoter was inserted into multiple clone sites of pGL3-Basic vector. In 293T cells， we detected the gene expression and half maximal effective concentration（EC50）of RARE responding to RA and screened the possible target genes of regulating RARE. The pGL3-RARE-Luc plasmid and pShuttle vector were digested by restriction enzyme and ligated. Through transformation into competent cell BJ518 the recombinant adenovirus vector Ad-Basic-RARE-Luc was obtained and amplified after transfection to MGH cells. The activity of recombinant adenovirus was detected in primary hepatocyte of a mouse with Dual-luciferase Reporter Assay System. The results indicated that luciferase reporter gene vector regulated by RARE in 293T cells was stimulated by RA. RARβ promoted the stimulation of RA in RARE regulation， and CRY1 prohibited the response of RARE-Luc to RA. The adenovirus vector Adeasy-Basic-RARE-Luc responding to RA stimulation in primary hepatocyte of a mouse was constructed successfully.

retinoid acid；RARE；luciferase reporter gene；circadian；metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.033

2014-11-24

袁源，碩士研究生，研究方向： 二型糖尿病與肥胖的分子病理研究 ；E-mail：stacyy116@hotmail.com

陳亞瓊，博士，研究方向：二型糖尿病與肥胖的分子病理研究；E-mail：yqchen@sibs.ac.cn