李云霞，陳雯雯，顧晨榮，饒名禎，郭魯申，趙 渝

(上海師范大學生命與環(huán)境科學學院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

0 引言

食源性疾病是指通過攝食而進入人體的有毒有害物質(zhì)(包括生物性病原體)等致病因子所造成的疾?。话憧煞譃楦腥拘院椭卸拘?，包括常見的食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲病以及化學性有毒有害物質(zhì)所引起的疾?。陙?，食源性疾患的發(fā)病率居各類疾病總發(fā)病率的前列，是當前世界上最突出的衛(wèi)生問題［1］．

李斯特菌(Listeria)為革蘭氏陽性菌，形狀為圓尾帶狀，是一種非芽孢兼性厭氧菌，包括7個菌種［2］，僅綿羊李斯特菌(Listeria iuanuii)和單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)兩種為致病菌，其中綿羊李斯特菌只在反芻動物中感染，人感染綿羊李斯特菌的情況極少甚至未見報道，而單增李斯特菌是唯一能引起人畜共患病的主要致病菌［3-4］．單增李斯特菌為革蘭氏陽性短桿菌，生長環(huán)境是需氧和兼性厭氧，可在極端的環(huán)境中生長和存活，如生長溫度為 -0．4 ～45 ℃［5］，pH 為 4．0 ～9．6［6］等．單增李斯特菌在自然界中廣泛存在，如水、土壤、植物，由于其能耐各種極端環(huán)境的生物學特性使其易通過各種途徑發(fā)生播散，可造成多種食品的污染，如奶及奶制品、肉制品水產(chǎn)品、新鮮蔬菜等．人類受感染后可導致胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)，尤其是孕婦、嬰兒、老年人及免疫力低下者更易感染［7-8］．可見，食品中存在的單增李斯特菌對人類的健康安全具有很大的威脅．因此，研究高效可行快速的檢測方法來提高該菌的檢驗速度和靈敏度，使受李斯特菌污染的食品得到及時的處理，保證食品安全進入流通領域，使危害消費者健康的風險降低至最小程度，顯得十分必要．

1 單增李斯特菌的檢測方法

1．1 傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法

在例如熱、冷凍干燥、干燥、鹽、防腐劑、以及其他化學品或天然抗微生物化合物等因素存在下，食品中的致病菌可能次致死受傷(sub-lethally injured)［9］．另外，面對各種環(huán)境脅迫，致病菌為了保持存活進入休眠狀態(tài)，在實驗室培養(yǎng)基是不可培養(yǎng)(non-culturable，VBNC)的［10］．如果從VBNC狀態(tài)復蘇，細胞可以再次進行培養(yǎng)而引起感染．因此，在培養(yǎng)過程中復蘇是至關重要的．

由于致病菌存在次致死受傷(sub-lethally injured)和VBNC狀態(tài)，檢測方法通常分為兩步增菌過程．分離培養(yǎng)得到的可疑菌落再做一系列生化反應實驗、溶血實驗、協(xié)同溶血實驗(CAMP)等免疫學檢測，被確定為李斯特氏菌后進一步進行血清分型．整個檢驗周期較長，需4～7 d左右．目前我國常用的檢驗方法主要是國標法(GB 4789．30—2010)［11］，其采用的平板培養(yǎng)法靈敏度高，成本低，可以給出定性和定量的結(jié)果，但是步驟多、過程較復雜、周期長．Zunabovic等人［12］已經(jīng)指出許多單增李斯特菌的官方檢測方法(如國際標準化組織(International Organization for Standardization(ISO)和FAD)的不同，它們使用不同的前增菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間，而培養(yǎng)溫度是相同的(30℃)．選擇性增菌培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度(30/35/37℃)和時間依據(jù)各種標準而不同．近年來，常規(guī)的傳統(tǒng)微生物分析方法已經(jīng)被改進為快速、便捷的簡便方法，如在選擇培養(yǎng)基上使用熒光或顯色底物并且避免進行進一步做生化測試的需要．商業(yè)化的形態(tài)、生化、生理檢測也經(jīng)常使用傳統(tǒng)常規(guī)檢測方法［13］．

1．2 快速檢測方法

1．2．1 免疫學方法

免疫學方法是基于抗原和抗體特異性結(jié)合．抗原的抗原決定簇可識別抗體上的表位并與之結(jié)合．單克隆抗體可以識別一個特定的表位，而多克隆抗體則可以識別特定抗原或多個抗原的幾個表位．抗體和免疫學檢測的類型影響單增李斯特菌的檢測限．目前廣泛使用的檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)、側(cè)流免疫法(Lateral Flow Immunoassay)和免疫磁性分析(IMS)等．

ELISA法是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理．在測定時，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析，通常使用的是夾心ELISA．Shim等人［14］研究了免疫層析法(Immuno Chromato Graphy，ICG)條帶測試和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)聯(lián)合IMS(3B12-17 MAb)定量測定單增李斯特菌．他們使用116個自然污染的肉類樣品，運用ICG-IMS可在15 h內(nèi)檢測出這些致病菌，檢測限達到102cfu/10g．Portanti等［15］針對肉類、海鮮和乳制品中的190個自然和30個人為污染的樣品，用ISO方法驗證ELISA法，得到的結(jié)果和標準一致，檢測限為6．6×103cfu/mL并且在樣品中的相對檢測限為5～10 cfu/g．

為了提高ELISA法的靈敏度，可將熒光標記物添加到抗體上(ELFA)．目前酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)法常用的標記物為堿性磷酸酶，首先將LM抗原與單克隆抗體結(jié)合，再將結(jié)合有堿性磷酸酶的抗體與LM抗原結(jié)合．堿性磷酸酶作用于底物4-甲基傘形磷酸酮，使之轉(zhuǎn)換成4-甲基傘形酮而發(fā)出熒光．通過檢測熒光強度(熒光強度與抗原含量成正比)可推算出樣品中單增李斯特菌的數(shù)量．對于22種自然污染的奶酪、魚、牛奶、草莓樣品，Jaakohuhta等［16］用時間分辨熒光免疫分析(Time-resolved FIA)和商業(yè)ELISA法進行檢測比較，兩種方法很好地相關，但是前者花費時間更少(16 h)且更靈敏(20 cfu/mL)．

此外，側(cè)流免疫法或免疫色譜法(immunochromatography)的抗體和其靶標物反應是肉眼可見的，它依賴于樣品中的靶標物向固定在膜表面的抗體遷移．Cho等人［17］研究了一種側(cè)流層析免疫法聯(lián)合磁選步驟，在牛奶樣品中用單增李斯特菌的單克隆抗體LZF7和LZH1在2h內(nèi)檢出靶標菌，檢測限為102cfu/mL．

1．2．2 生物傳感器

生物傳感器(biosensor)是一種由生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件組成的檢測目標化合物的分析裝置．其中，生物識別元件(感受器，bioreceptor)是具有分子識別能力的生物活性物質(zhì)(如細胞、細胞器、細胞膜、酶、抗體、核酸、有機物分子等);信號轉(zhuǎn)換元件(換能器，transducer)主要有電化學電極、表面等離子共振器件、場效應晶體管等．生物傳感器的原理是信號轉(zhuǎn)換元件可以將待測物與分子識別元件特異性結(jié)合后，所產(chǎn)生的復合物(或光、熱等)轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?、光信號等，從而達到分析檢測的目的．生物傳感器有多種分類方法，根據(jù)生物傳感器的信號轉(zhuǎn)換器可分為電化學式生物傳感器、光學式生物傳感器等．

Radhakrishnan等人［18］在沒有增菌的前提下，用交流阻抗法和單克隆IgG1抗體檢測出人工接種番茄提取物的單增李斯特菌，檢測限可達4 cfu/mL．Leonard等［19］采用BIAcore3000生物傳感器檢測Listeria monocytogenes，30min 內(nèi)，檢測限可達到 1 ×105cell/mL．Davis等［20］用絲網(wǎng)印刷碳電極(screen-printed carbon electrode，SPCE)條作一次性安培傳感器(disposable amperometric sensors)，在1 h內(nèi)檢測出藍莓樣品中的單增李斯特菌，檢測限為102cfu/g．Vaughan等［21］用石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)對Listeria monocytogenes進行快速檢測，研究表明:在溶液中，該傳感器實時檢測李斯特菌的檢測限是1×107cells/mL，該傳感器能夠重復使用10次以上．Sharma等［22］用懸臂梁壓電生物傳感器和商業(yè)的抗單增李斯特菌多克隆抗體在牛奶樣品中檢出目標菌，檢出限為103cells/mL，此方法增加第3個抗體連接步驟，可使檢出限1 h內(nèi)降低到102cells/mL．這些使用生物傳感器的檢測方法的檢測時間都小于24 h，有的甚至只需短短幾小時，但是它們的檢測限通常要比使用擴增方法高，可見該方法的靈敏度有待提高．

1．2．3 基于噬菌體的檢測方法

基于噬菌體檢測方法在食品安全和檢測中的應用很早就被提及［23-24］，其優(yōu)點包括檢測目標的特異性強，靈敏度高，可以區(qū)分死活細胞等．可用噬菌體尾蛋白的商業(yè)免疫學方法檢測單增李斯特菌，在市場上也有用噬菌體在李斯特菌細胞中產(chǎn)生修飾報告蛋白的系統(tǒng)．通過使用超順磁珠，噬菌體蛋白可對李斯特菌進行分離、檢測．從275個自然污染的食品樣品(生菜、奶酪、三文魚、肉類、牛奶)中可以檢出該致病菌，經(jīng)6 h前增菌后，所有食品樣品的檢測限為102cfu/g，而24 h增菌后，除軟奶酪之外所有樣品的檢測限可達0．1 cfu/g，其靈敏度要比標準培養(yǎng)方法高［25］．Walcher等［26］用噬菌體蛋白包裹的磁珠從污染的牛奶樣品中分離單增李斯特菌，再用RT-PCR等檢測靶標菌．這使得IMS、DNA-isolation和RT-PCR(在prfA;毒力因子的轉(zhuǎn)錄激活因子下)檢測限可達102～103cfu/mL．

1．2．4 分子生物學方法

被單增李斯特菌污染的樣品通常細菌量少，給檢測帶來很大的難度，而分子生物學檢測方法通過擴增少量細菌中特定的基因信號而達到檢測的目的．目前，很多分子生物學方法現(xiàn)已被用于食品樣品中單增李斯特菌的檢測，如核酸探針雜交技術(shù)和PCR技術(shù)等，其中以常規(guī)PCR技術(shù)為基礎的各種新型PCR技術(shù)(如定量PCR(qPCR)、實時熒光PCR(Real-time PCR)、多重PCR等)不斷出現(xiàn)，并廣泛應用于單增李斯特菌的檢測，使得食品中單增李斯特菌的檢測愈來愈快捷簡便．近年來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，在PCR基礎上又開發(fā)了一些新的檢測技術(shù)，如恒溫擴增［27］，包括環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、超分支滾環(huán)擴增技術(shù)(hyperbranchedrolling cycle amplification，HRCA)、核酸序列依賴性擴增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)．

1．2．4．1 多重 PCR

多重PCR是在同一PCR反應體系中加入2對或2對以上的引物，可同時擴增出多個核酸片段進行檢測，該方法能同時檢測出多種病原菌．Kanuganti等［28］用李斯特菌屬的23SrRNA基因和單增李斯特菌的hlyA特異基因，能在樣品中同時鑒定單增李斯特菌和李斯特菌屬的其他細菌．Zeng等人［29］用多重PCR在牛奶樣品中檢測李斯特菌屬和單增李斯特菌，以及牛奶加工環(huán)境中(原料奶、污水、容器表面)分離得到的單增李斯特菌的iap和hly．Germini等［30］使用多重PCR檢測液體狀態(tài)蛋樣品中的單增李斯特菌(prfA基因)、沙門氏菌、大腸桿菌，在經(jīng)過15 h增菌后檢測限為0．4 cfu/g．

1．2．4．2 實時熒光 PCR(Real-time PCR)

實時熒光PCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎上，在反應混合物中加入熒光標記，它能結(jié)合在雙鏈DNA的位置，依據(jù)循環(huán)的增加而導致熒光量的增加，可直接對靶DNA進行定量的檢測．其減少了檢測過程假陽性的發(fā)生率，縮短檢測周期，彌補了常規(guī) PCR技術(shù)靈敏度低、特異性差等缺點．Rossmanith等［31］用實時熒光PCR在人工污染的牛奶和三文魚、鵝肝醬、奶酪樣品中檢測單增李斯特菌(prfA)，檢測限分別為0．3 cfu/mL和0．07 ～0．6 cfu/g．Rodriquez-Lazaro等人［32］用實時熒光 PCR 檢測豬肉、家禽肉類，即食生菜沙拉和奶酪樣品的單增李斯特菌，當25 g樣品稀釋1∶10時檢測結(jié)果最好，經(jīng)過24 h富集后可在27 h內(nèi)完成檢測，檢測限為 0．08 ～0．16 cfu/g．

1．2．4．3 核酸探針雜交技術(shù)

核酸探針雜交技術(shù)是以李斯特菌屬或種特異核酸序列(RNA或DNA)為探針，可以進行李斯特菌屬或種水平上的鑒定．1988年，Datta等人［33］克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一個500 bp DNA片斷并進行測序，以此序列合成4種寡核苷酸探針，經(jīng)斑點雜交實驗證實，該探針只與李斯特氏菌反應，與其他種的李斯特氏菌和屬外的細菌均呈陰性，該方法表現(xiàn)出很好的特異性．但探針雜交無法分辨死菌和活菌，所以檢測無法完全避免假陽性結(jié)果．隨著探針技術(shù)的逐漸成熟，研究人員將多個DNA特異性探針固定到芯片上，制成基因芯片，采用熒光標記法提高檢測靈敏度．基因芯片能夠同時檢測多種菌，可以減少實驗次數(shù)，并且檢測所需的引物較少．Volokhov等［34］以李斯特的6種毒力蛋白基因為靶基因設計多重PCR，從而開發(fā)出了基因芯片檢測單增李斯特菌，檢測時可達到種的水平．

1．2．4．4 恒溫擴增技術(shù)

恒溫擴增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的一門新型的體外核酸擴增技術(shù)，它是一種以恒溫方式擴增DNA及RNA的方法，如LAMP、HRCA、NASBA等．該方法有操作簡便、特異性好、靈敏度高不需要特殊的儀器設備等特點．環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi等［35］2000年建立的體外擴增特異DNA片段的分子生物學技術(shù)，LAMP法是針對靶基因上的6個區(qū)域設計4條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進行擴增反應，可在15～60 min內(nèi)實現(xiàn)109～1010倍的擴增，反應能產(chǎn)生大量的擴增產(chǎn)物即焦磷酸鎂白色沉淀，可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷靶基因是否存在．Wang等［36］以單增李斯特菌的iap基因作為引物，采用LAMP法檢測125個牛奶樣品中單增李斯特氏菌，建立了食品中單增李斯特菌LAMP檢測方法，當經(jīng)過6 h富集，該方法100%與ISO標準一致，檢測限為186 cfu/mL．Wan等［37］基于單增李斯特菌hlyA靶向基因，用單疊氮丙啶的LAMP法檢測雞肉、豬肉、牛肉和奶粉中的單增李斯特菌，在純培養(yǎng)情況下檢測限為102cfu/mL而在全部測試食品樣品情況下則為3．1×103cfu/g．

2 各種檢測方法的特點

單增李斯特菌檢測方法很多(表1)，都具有不同特點，并且檢測的靈敏度通常隨前增菌而增加．常規(guī)(培養(yǎng)和色譜)技術(shù)是基于表型測試．其優(yōu)點是操作簡單、可操作性強、成本低，但是檢驗周期較長、特異性低，不能滿足食品中單增李斯特菌及時、快速、靈敏的檢測要求，不利于食品的監(jiān)督管理和疾病預防［41-42］．在現(xiàn)場監(jiān)管或疾病快速診斷時，單增李斯特菌的各種快速檢測方法表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，然而最終確認單增李斯特菌仍然需要依靠傳統(tǒng)常規(guī)檢測技術(shù)．

免疫學方法的特異性是基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，該方法檢測可以實現(xiàn)自動化，速度快，重復性好，對于食品中存在的干擾不敏感，其特異性并無足夠高且靈敏度低于分子生物學的方法．生物傳感器檢測快速(＜24 h)，有的甚至只需幾個小時，分析檢測步驟簡單，使在線實時檢測成為可能．但是，其檢測限要比其他方法高，所以在靈敏性方面，生物傳感器還有待提高．此外生物傳感器的響應時間和壽命還需要進一步加快和延長．基于噬菌體的檢測方法在檢測時目標的特異性強，靈敏度高，可以區(qū)分死活細胞．

相對于其他技術(shù)，使用DNA或RNA序列作為靶向序列的分子生物學方法特異性更強，Jasson等［41］研究發(fā)現(xiàn)相比于DNA，RNA提供了有關細菌生存能力的更多信息并有更高的靈敏度;另一方面，由于rRNA較穩(wěn)定，細菌細胞死亡后其降解速度較慢，以rRNA作為靶向序列的檢測可能就會出現(xiàn)假陽性結(jié)果［43］．分子生物學方法檢測迅速、可重復性強，能夠同時設置多參數(shù)檢測，并且可實現(xiàn)自動化．但是，分子生物學方法存在一定的缺陷:其花費的成本較高，在檢測過程中出現(xiàn)假陽性率偏高，并且易對食品的品質(zhì)產(chǎn)生負面影響，尤其是PCR法［41-42］．

除了檢測步驟外，多數(shù)方法包括樣品制備或富集，這些都會對最終的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響．同樣地，食品的種類、食品樣品中其他微生物對目標病原體的應力條件(如亞致死損傷的細胞)都會影響檢測結(jié)果［41］．

表1 單增李斯特菌的常規(guī)檢測方法和各種快速檢測方法

3 總結(jié)

單增李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，雖然感染率較低，但死亡率很高．盡管我國尚未有相關單增李斯特菌食物中毒的報導，但這種病菌在自然界廣泛存在，食品中存在的單增李斯特菌對我國人民的健康帶來了很大的威脅，因此在食品上市和消費前開展李斯特菌的相關檢測非常必要．隨著對復雜生物體系中痕量組分檢測的要求越來越高，超高靈敏度檢測在食品安全中的需求也越來越高．目前我國主要的檢測方法為傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法結(jié)合顯色培養(yǎng)基和基于生化反應的VITEK系統(tǒng)進行檢測，檢測時間較長，無法滿足對食品的實時檢測需要．而現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出多種單增李斯特菌的快速檢測方法，并且可在48 h內(nèi)完成檢測．對于單增李斯特菌的快速檢測，免疫學方法、分子生物學方法仍然是主線．另外，檢測中增菌時間正在縮短或者一些新技術(shù)中無需前增菌．目前，進一步改進現(xiàn)有的快速檢測方法或?qū)⒁延械姆椒ㄓ袡C結(jié)合，建立一套更加快速、準確、簡便的檢測體系運用到實際樣品檢測中是今后研究的重要內(nèi)容．

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