李 瓊　伍 輝

（重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 401120）

HPV21亞型結(jié)果的實驗室間比對體會

李 瓊伍 輝

（重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 401120）

目的 通過對HPV21亞型實驗結(jié)果的室間比對，評價實驗室是否有開展此項目的力。方法 采用室間比對的方法對23例隨機樣本進行HPV分型檢測。結(jié)果 該實驗室結(jié)果與比對實驗室結(jié)果存在分歧。結(jié)論 在操作HPV分型實驗過程中，嚴格按操作說明進行，防止偶然誤差出現(xiàn)。

HPV21；室間比對；偶然誤差

子宮頸癌是女性最常見的癌癥之一，僅次于乳腺癌。宮頸癌的發(fā)生與多種因素有關，如病毒感染、生活方式、環(huán)境及身體免疫狀況等。大量研究表明，90%以上宮頸癌與人乳頭瘤病毒（HPV）感染有關［1］。宮頸癌是WHO建議在世界范圍內(nèi)開展篩查的腫瘤，而癌前病變早期篩查及及時治療是預防子宮頸癌發(fā)生的有效措施［2-3］。目前篩查子宮頸癌前病變與子宮頸癌主要采用液基薄層細胞檢測技術（TCT），此技術易受到多種因素的干擾而造成假陰性結(jié)果，以致造成漏診，延誤受檢者病情。凱普HPV分型檢測是中國宮頸癌防治工程唯一指定的產(chǎn)品（ISO13485：2003），目前是臨床上應用較多的HPV分型檢測方法，該方法以PCR-DNA擴增法為基礎，應用導流雜交技術，可以同時檢測21種HPV亞型病毒感染，該法聯(lián)合TCT檢測可提高宮頸癌及癌前病變的早期檢出率［4-5］。為了驗證該方法在該實驗室的檢測結(jié)果與其他實驗室檢測結(jié)果一致性，利用該實驗室場地對凱普導流雜交法檢測結(jié)果進行了驗證。

1　資料與方法

1.1資料：①實驗對象：該地區(qū)自愿受試者婦女樣本，年齡30～55歲。②儀器與試劑。DNA提取試劑、雜交試劑與雜交儀：潮州凱普生物科技有限公司提供；DNA擴增儀：達安公司DA-7600。

1.2方法：①樣本采集：按采集液基薄層細胞檢測技術樣本采集，由婦科醫(yī)師刷取宮頸脫落細胞儲存于HPV反向雜交法專用采樣瓶中。②核酸提取：按凱普一步法核酸提取試劑說明書提取。③核酸PCR擴增：將PCR-Mix、Tad酶和DNA模板按要求混勻，體系26 μL/反應，DNA擴增在DA7600核酸擴增儀上進行，循環(huán)條件如下：95 ℃預雜交9 min，（95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）40個循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃HOLD。④HPV導流雜交分型：操作按試劑說明書進行樣本經(jīng)DNA提取、PCR擴增后，與檢測膜條進行雜交顯色，出現(xiàn)藍色斑點即為有相應的HPV亞型陽性。⑤驗證標準：獨立實驗室反向雜交法實驗結(jié)果；某三甲醫(yī)院實驗室的凱普導流雜交法實驗結(jié)果。

2　結(jié) 果

2.1該實驗室 23例隨機標本中，檢出4例HPV陽性，分別是16、18、33、53亞型，19例陰性；獨立實驗室與某三甲醫(yī)院實驗室23例標本中，1例陽性，即16亞型，22例陰性（表1）。

表1　不同實驗室陽性實驗結(jié)果

2.2該實驗室2人分別再次對23例隨機樣本檢測，結(jié)果與獨立實驗室和某三甲醫(yī)院實驗室實驗結(jié)果一致（表1）。

3　討 論

由于人們對醫(yī)院的等級在意和健康意識提高，一次檢測結(jié)果，尤其是陽性結(jié)果，不可能在一家醫(yī)院檢測后，就認同，他們會去信任度高的三甲醫(yī)院實驗室再次檢測，且認為三甲醫(yī)院實驗室的實驗結(jié)果可靠。按《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》的要求與使患者對該實驗室抱有更高的信任度，該實驗室對HPV21亞型實驗結(jié)果進行了室間比對，通過比對，確實發(fā)現(xiàn)了問題，不是儀器、試劑、方法的問題。而是人員問題，不按試劑盒操作說明書進行操作，憑經(jīng)驗操作，勿視實驗條件，該室當時室溫10 ℃，由于雜交液與B液試劑沒預熱至45 ℃，清洗次數(shù)隨意減少，導致膜條背景不干凈，出現(xiàn)假陽性。因此在實際操作中需重視每個環(huán)節(jié)，否則造成假陽性與假陰性結(jié)果，失去患者對結(jié)果的信任度。雖然凱普HPV分型檢測方法比較成熟，應用的實驗室比較多，但是在實際操作中也應注意一些環(huán)節(jié)。

3.1標本預處理：①合格標本檢查：洗脫管完整，沒有破損或漏液；標本不應是血性標本；標本保存得當，常溫保存應＜12 h，4 ℃保存應＜7 d，-20 ℃保存應＜3個月或應低溫運輸?shù)?；宮頸脫落上皮細胞數(shù)鏡檢應＞15～20個/HP。②提取的DNA純度（A260/280）需達到1.7～2.0，DNA濃度為≥3 ng/μL。③檢測中設置陰性、陽性對照，控制實驗過程中可能由操作引起的假陽性問題。

3.2雜交過程：①實驗前準備，雜交檢測試劑平衡至室溫；雜交液使用前預熱至45 ℃，如不預熱至45 ℃，雜交不充分，可能造成假陰性；觀察NBT/BCIP是否有紫色或藍色沉淀出現(xiàn)，如出現(xiàn)，更換并準備新鮮NBT/BCIP溶液；觀察溶液B中是否出現(xiàn)沉淀，如出現(xiàn)，加熱至45 ℃溶解，然后平衡至室溫，如果不預熱45 ℃溶解，就不能完全洗脫膜上的顯色劑NBT/BCIP，膜背景不干凈，造成假陽性。②雜交儀前準備，儀器升溫45 ℃；反應室充滿蒸餾水，放好金屬多孔板，排除多孔板上面水分后，關閉水泵，這一步是清洗反應室與多孔板，排空氣體和檢查多孔板與反應室是否是通的；雜交膜應放置在塑料膜對應孔上，如有多于孔應封閉，是為了確保雜交膜濕潤且沒有氣泡。③雜交過程，PCR產(chǎn)物預熱后立即冰水浴至少2 min，保證PCR產(chǎn)物單鏈結(jié)構；雜交液加入雜交孔內(nèi)，預熱45 ℃，再泵出是必須的，為保證孔是通的且無氣泡；雜交后用45 ℃雜交液沖洗膜3次，保證未雜交的多余標本全部排出。④顯色過程，A液、B液和蒸餾水清洗膜時，要徹底，保證多余酶標液與多余顯色液全部清洗干凈，使背景干凈，避免引起假陽性。

3.3試劑保存：PCR Mix 、DNA Taq 陽性對照與陰性對照存于-20 ℃；雜交液、封阻液、酶標液、溶液A、溶液B、雜交膜和NBT/BCIP存于4 ℃。

總之，隨著HPV導流雜交技術的普及，無論它多么成熟及完善，都應嚴格按操作步驟謹慎完成，不能隨意改變儀器及試劑要求的溫度及沖洗的時間和次數(shù)，無論哪個環(huán)節(jié)失誤，最終都將導致實驗結(jié)果不可靠，出現(xiàn)偶然誤差，對受檢者影響不好：假陽性造成受檢者精神和經(jīng)濟負擔，浪費TCT檢查、陰道鏡檢查及病理活檢等醫(yī)療資源；假陰性延誤受檢者病情，對實驗室影響不好，失去信任度。

［1］曲守方，于婷，孫楠，等.人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒評價［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志，2015，36（2）:181-182.

［2］曹秀華.宮頸液基細胞學聯(lián)合HPV-DNA檢測在宮頸病變中的應用［J］.河北醫(yī)學，2015，37（3）:414-415.

［3］顏衛(wèi)山.人乳頭瘤病毒分型聯(lián)合液及細胞學檢測在宮頸病變患者篩查中的應用［J］.中國民康醫(yī)學，2015，27（2）:53-54.

［4］李建軍，周海清.TCT聯(lián)合HPV-DNA檢測在宮頸癌前病變篩查中的價值［J］.基層醫(yī)學論壇，檢驗與臨床，2015，19（5）:662-663.

［5］韋娟.宮頸液基細胞學檢查與高危型HPV檢測用于宮頸癌前病變早期篩查對比分析［J］.吉林醫(yī)學，2015，36（3）:489-490.

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1671-8194（2015）18-0044-02