呂文龍　趙 玉　徐鐵軍

（1 江蘇省連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術學校，江蘇 連云港 222007；2 徐州醫(yī)學院人體解剖學與神經(jīng)生物學教研室，江蘇 徐州 221002）

星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)干細胞分化的影響實驗研究

呂文龍1趙 玉2徐鐵軍2

（1 江蘇省連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術學校，江蘇 連云港 222007；2 徐州醫(yī)學院人體解剖學與神經(jīng)生物學教研室，江蘇 徐州 221002）

目的 研究星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)干細胞分化的影響。方法 隨機在我院動物實驗中心選取3只大鼠為研究對象，將本次實驗均分為普通星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)的對照組以及星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)干細胞互不接觸狀態(tài)下共同培養(yǎng)的實驗組。對比兩組星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)干細胞分化的影響效果。結(jié)果 實驗組的純化星形膠質(zhì)細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體標記為陽性，其細胞純度高到96%，且在神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性細胞與酪氨酸羥化酶陽性細胞均比對照組多。結(jié)論 星形膠質(zhì)細胞不僅可以加快神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元細胞的分化以及向多巴胺神經(jīng)元細胞的分化，而且可以延長神經(jīng)元存活時間，降低神經(jīng)元凋亡率。

星形膠質(zhì)細胞；神經(jīng)干細胞分化；療效

作為可以有效促進人體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及成熟的細胞之一，星形膠質(zhì)細胞主要以其分泌產(chǎn)生的一定的膜關因子以及可溶性因子為誘因，加快中樞神經(jīng)細胞的成熟及分化［1］。由于我國對此類研究的數(shù)量過少，因此就星形膠質(zhì)細胞對人體神經(jīng)干細胞分化及存活等方面的研究十分必要。

1　資料與方法

1.1一般資料：實驗材料為0～3 d的新生3只大鼠，數(shù)量為3只，實驗動物中心提供。主要試劑與設備：干粉培養(yǎng)基、B27；bFGF、EGF、PLL；小鼠抗人NestinIg G及NSE 單克隆抗體，兔抗 GFAP 多克隆抗體與IgG -HRP羊抗兔等。 同時，還有胰蛋白酶；小鼠抗 TH 單克隆抗體；病理圖像分析儀與氣浴恒溫振蕩床［2］。

1.2方法

1.2.1取材與培養(yǎng)：取新生0～3 d的3只大鼠的腦組織海馬，并將其分離放置于平衡鹽溶液的培養(yǎng)皿中進行漂洗。在用平衡鹽溶液將海馬清洗3次后，將其移進無菌小瓶中，剪至適當尺寸的組織塊，采用吸管吹打后。在37 ℃下加入6.5倍量左右的2.5%胰蛋白酶，進行消化15 min，待組織塊出現(xiàn)變化至疏松且顏色發(fā)白時，可將其取出，并用胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基停止消化，并進行相關操作將其制成單細胞懸液；然后選取濾網(wǎng)過濾5 min（1000 r/min），去掉上清液后，將20 μg/L表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基和含2%的B27、10μg/L 堿性成纖維生長因子洗滌細胞2次，反復離心去除上清液后，加入適量的培養(yǎng)液，將其制成細胞懸液，活細胞在椎蟲藍染色后進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度，后接種置與25 mL的培養(yǎng)瓶；在飽和濕度下，體積為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在初次換液時，采用分瓶法，往后均2.5 d左右后進行1次換液；在培養(yǎng)5～6 d后，將發(fā)育長至200 μm的神經(jīng)干細胞分離細胞克隆球傳代（機械分離）。

1.2.2對膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)：取出新生3 d的3只大鼠的大腦組織，剪至適當尺寸的組織塊在通過0.25%胰蛋白酶，并在消化0.5 h后（37 ℃下）通過400目紗網(wǎng)進行過濾。然后在預先配置好的營養(yǎng)液中將過濾的相關組織打散成懸液狀，進而將其接種在玻璃培養(yǎng)皿上。最終進行膠質(zhì)纖維酸性蛋白標記以及相關純度鑒定。

1.2.3實驗組的細胞培養(yǎng)：實驗組是的細胞培養(yǎng)運用胰蛋白酶把培養(yǎng)基上的星形膠質(zhì)細胞消化為單細胞懸液，再以一定的細胞數(shù)量放置于12孔培養(yǎng)板上加進完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，其培養(yǎng)基上的溫度、培養(yǎng)時間以及更換培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)液的間隔時間均必須嚴格按照要求進行，直到第7天時便可以對蓋玻片上培養(yǎng)的細胞進行染色檢查。

1.2.4免疫細胞化學染色和細胞計數(shù)及統(tǒng)計學分析：對培養(yǎng)基上載玻片上采用免疫細胞化學染色的方法進行研究星形膠質(zhì)細胞對干細胞分化的影響因素，其具體的操作必須嚴格按照要求進行實施，并計算染色下細胞陽性的發(fā)生率。

1.3統(tǒng)計學方法：使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對上述星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)干細胞分化的數(shù)據(jù)進行分析，采用t檢驗與卡方檢驗進行相關指標的測試與分析。當P＜0.05時，有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié) 果

實驗組的純化星形膠質(zhì)細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體標記為陽性，其細胞純度高到96%，而且在神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽性細胞與酪氨酸羥化酶陽性細胞均比對照組多。見表1。

3　討 論

表1　兩組的臨床療效

作為人體神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量極多的細胞之一，星形膠質(zhì)細胞不僅具有提高人體神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及相關營養(yǎng)的供給，而且具有修復神經(jīng)組織、促進神經(jīng)干細胞分化以及神經(jīng)免疫、促進細胞再生等重要作用［3］。

研究表明，在人體中樞神經(jīng)細胞中，星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量為神經(jīng)元細胞的30倍左右，且二者相互作用，相互影響。由上述結(jié)果可知，將星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)干細胞共同培養(yǎng)的實驗組較之普通培養(yǎng)的對照組，在細胞接種之后，其細胞球不僅細胞貼壁速度快，而且分化程度差異較大，尤其在培養(yǎng)4 d后。采用光鏡進行觀察，其細胞的胞體不大、邊緣光滑、立體感較強的神經(jīng)元樣細胞，而對照組在這類細胞的數(shù)量明顯要少、細胞的狀態(tài)生命力較弱；免疫細胞化學結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組的神經(jīng)元及多巴胺神經(jīng)元明顯較對照組高，且星形膠質(zhì)細胞的比例均較對照組低。綜上所述，與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)與神經(jīng)干細胞分化相比，采用星形膠質(zhì)細胞聯(lián)合神經(jīng)干細胞共同培養(yǎng)中，星形膠質(zhì)細胞不僅可以加快神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元細胞的分化以及向多巴胺神經(jīng)元細胞的分化，而且可以延長神經(jīng)元存活時間，降低神經(jīng)元凋亡率。值得臨床神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)上進一步推廣應用。

［1］羅杰峰.黎海燕.沈岳飛.星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)干細胞分化的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（42）:8515-8519.

［2］莊朋偉.張艷軍.龐坦.黃芩苷作用于腦微血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)干細胞分化的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（1）:43-47.

［3］張志琳.包仕堯.汪立平.鮑歡.星形膠質(zhì)細胞源性因子對神經(jīng)干細胞分化的實驗研究［J］.臨床神經(jīng)病學雜志，2006，19（1）:45-47.

Experimental Study of Astrocyte Differentiation of Neural Stem Cells

LV Wen-Long1，ZHAO Yu2，XU Tie-Jun2
（1 Jiangsu Lianyungang Higher Vocational Technical College of Traditional Chinese Medicine，Lianyungang 222007，China；2 Depamrtent of Human Anatomy and Neurobiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China）

Objective To study the effects on neural stem cell differentiation astrocytes. Methods Experimental animal center in our hospital three rats were selected for the study，will this experiment were divided into normal astrocytes cultured in the control group as well as astrocytes and neural stem cells do not touch each state experimental group co-cultured. Compared two groups of astrocytes on neural stem cell differentiation effects. Results The purified astrocytes and glial fibrillary acidic protein antibody in the experimental group labeled as positive，its cells to 96% high purity and neuron-specific enolasepositive cells and tyrosine hydroxylase-positive cells were than the control group. Conclusion Astrocytes not only accelerate the differentiation of neural stem cells into neurons and differentiate into dopaminergic neurons，and can prolong the survival time of neurons，reducing neuronal apoptosis.

Astrocytes； Neural stem cell differentiation； Efficacy

R-332

B

1671-8194（2015）18-0019-02