金瑩 房保海 劉新亮 孫濤 賈俊濤 趙麗青 孫雯嫻

摘要 ?[目的] 建立一種通過焦磷酸測序技術(shù)檢測大豆過敏原成分的方法。[方法]針對大豆GlymBd30K基因設(shè)計特異性PCR引物和焦磷酸測序引物，利用設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增各測試材料的特異基因片段并進(jìn)行焦磷酸測序。 [結(jié)果]該檢測方法對大豆過敏原成分具有非常好的重現(xiàn)性和特異性，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比對分析，表明目標(biāo)序列能夠作為鑒定GlymBd 30K基因很好的序列。[結(jié)論]為食品中的大豆過敏原成分快速檢測提供很好的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 焦磷酸測序;大豆;過敏原;PCR

中圖分類號 S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-029-03

The Detection of Allergen GlymBd 30K in Soybean by Pyrosequencing Technology

JIN Ying¹， FANG Baohai2*， LIU Xinliang³et al

（1.Huangdao Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong ?266555; 2.Inspection and Quarantine Technical Center of Shandong Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Qingdao， Shandong ?266002; 3. Heilongjiang Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau， Haerbin， Heilongjiang ?150001）

Abstract ?[Objective]To establish a rapid method to detect soybean allergens by pyrosequencing technology. [Method] The conserved sequences for GlymBd30K gene specific PCR amplification， and then using pyrosequencing technology for PCR amplification products.Using primers design specific gene fragments in tested materials were amplified， and then pyrosequencing. [Result] The results had very good reproducibility; the sequencing results were homology found in GenBank. The target sequence to sequence as the identification of GlymBd 30K gene was very good.[Conclusions] A simultaneous quantitative detection of 96 samples by pyrosequencing rapid detection methods was Successfully established， it will provide good technical support for rapid detection of allergens for export soybeans and their products.

Key words ?Prosequencing;Soybean;Allergen; PCR

基金項(xiàng)目 國家質(zhì)檢總局項(xiàng)目（2011IK221）。

作者簡介 金瑩 （1981- ），女，山東沂水人，農(nóng)藝師，博士，從事食品安全方面的研究。*通訊作者，高級工程師，博士，從事食品安全檢測技術(shù)研究。

收稿日期 20141211

大豆是一種常見的食品過敏原，被稱為八大類食品過敏原之一，美國、歐盟等都要求在食品標(biāo)簽中強(qiáng)制性標(biāo)識。大豆GlymBd 30K蛋白是大豆的主要過敏蛋白，也被稱為P34蛋白或30K，廣泛存在于所有大豆品種中。研究表明，65%的大豆過敏癥狀都是由GlymBd 30K蛋白引起的，因此GlymBd 30K蛋白被視為大豆蛋白中一個重要的免疫顯性過敏原^[1-3]。早在1998年Takano就在NCBI數(shù)據(jù)庫中提交了大豆GlymBd 30K的DNA序列（AB013289），而2006年研究者^[4]在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫中提交了大豆GlymBd 30K的mRNA序列（DQ324851）。目前，已有研究建立了ELISA 法、 PCR 法等方法檢測過敏原大豆成分，然而這些方法存在一些不足之處，如蛋白質(zhì)耐熱性差，不適宜于現(xiàn)場快速檢測等缺點(diǎn)。

焦磷酸測序技術(shù)（Pymsequencing） 是1998年發(fā)明的一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行的實(shí)時DNA測序技術(shù)，是由4種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于對已知短序列的測序分析，無需熒光標(biāo)記引物或核酸探針，無需電泳，具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、自動化和實(shí)時檢測的特點(diǎn)^[5]。筆者首次建立大豆GlymBd 30K基因的焦磷酸測序快速檢測方法，為我國進(jìn)出口大豆及其制品的過敏原快速檢測提供很好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆來源于山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心檢驗(yàn)的進(jìn)境大豆樣品。

綠豆、赤豆、豇豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、花生等均購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

PCR擴(kuò)增引物（金斯瑞生物科技公司合成）：上游引物Bd 30KF2 5′ GCGGATGGTGTAGATTACTGGA 3′;下游引物eBd 30KR2 5′ ACCTTTAACGCGAGCAGACA 3′ ，5′端標(biāo)記生物素，擴(kuò)增長度188 bp。

焦磷酸測序引物（金斯瑞生物科技公司合成）：Bd 30KS2 5′ CAAAGAAACACGGGTAA 3′;測序得目標(biāo)序列為TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC。

2×GoTaq Master Mix PCR體系購自天根生化科技有限公司，50 bp和100 bp DNA Ladder Marker，均購自大連寶生物公司;焦磷酸測序試劑盒購自BD公司，試劑盒包括焦磷酸測序用酶、底物及各種dNTP、鏈酶親和素磁珠、綁定緩沖液、復(fù)性緩沖液、變性緩沖液、洗液。

1.2 儀器與設(shè)備

普通PCR儀（Mastercycler gradient）（德國 Eppendorf 公司）;電泳儀 （DYY6C），北京六一儀器廠;離心機(jī)（德國 Eppendorf 公司）：離心速度12000 r/min以上 ;冰箱：（4～10 ℃、-20 ℃）;微量可調(diào)移液器（德國 Eppendorf 公司）：10、100、200、1 000 μl;PyroMark ID檢測系統(tǒng)（瑞典Biotage公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制備。樣品處理：取大豆等試驗(yàn)材料100 g，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備用。

DNA模板的提取采用CTAB 法^[6]：取 200 mg 樣品于 50 ml 離心管中，加入 5 ml CTAB 提取緩沖液和 20 μl 蛋白酶K 溶液，充分混勻。 65 ℃振蕩過夜后，13 000 r/min 離心 20 min，轉(zhuǎn)移上清液700 μl至新的離心管中;加入 700 μl 三氯甲烷后用力振蕩，13 000 r/min 離心 5 min， 將上清轉(zhuǎn)移到新的2 ml eppendorf離心管中;加入 2 倍體積的 CTAB 沉淀液，室溫靜置 60 min，13 000 r/min 離心 5 min，棄去上清。加入 350 μl NaCl 溶液將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350 μl 三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 r/min 離心 10 min。轉(zhuǎn)移上清到新的2 ml eppendorf離心管中后加入 0.8 倍體積的異丙醇，室溫放置 60 min，13 000 r/min 離心 10 min，棄去上清。加入 500 μl 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μl TE 溶液中，立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×GoTaq Master Mix 25 μl，生物素標(biāo)記上游引物和下游引物各10 pmol，DNA模板2 μl，加無菌去離子水至50 μl。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，50個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫。取反應(yīng)產(chǎn)物5 ?μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余擴(kuò)增產(chǎn)物用于焦磷酸測序。

1.4 焦磷酸測序 ①將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入Sepharose beads 3 μl和Binding Buffer 47 μl，常溫混勻10 min。

②打開真空泵，將磁珠抓取臂（Vacuum Prep T001）在超純水中清洗30 s后移至96孔PCR板中，抓取磁珠，分別在70%乙醇中清洗5～10 s，變性緩沖液中變性5 s，洗液中清洗5～10 s。關(guān)閉真空泵，將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預(yù)先加人測序引物0.3 μmol/L和復(fù)性緩沖液共45 μl。

③將96孔測序板置80 ℃溫箱2 min，冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)。設(shè)定程序，堿基的加入為ATCG 6～10個重復(fù)，根據(jù)程序給定劑量（該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定，由儀器程序自動給出），在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及4種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機(jī)箱中進(jìn)行反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增引物特異性檢測

利用設(shè)計引物擴(kuò)增各測試材料的特異基因片段，電泳結(jié)果顯示，只有大豆樣品能夠擴(kuò)增出特異性基因片段188 bp，片段長度與引物設(shè)計的預(yù)期片段長度大小一致;綠豆、赤豆、豇豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、花生均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)（圖1和2），說明引物能夠?qū)Υ蠖固禺愋詳U(kuò)增。

注：1.綠豆;2.赤豆;3.豇豆;4.蠶豆;5.50 bp ladder marker;6.大豆;7.蕓豆;8.扁豆;9.花生;10.豌豆。

圖1 PCR擴(kuò)增引物特異性檢測

注：M.100 bp ladder marker。

圖2 部分實(shí)驗(yàn)室大豆樣品PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

43卷3期 ? ? ? ? ? ? ? 金 瑩等 焦磷酸測序技術(shù)檢測大豆過敏原成分GlymBd 30K基因

2.2 樣品焦磷酸測序結(jié)果

對13個進(jìn)口大豆樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果均進(jìn)行了焦磷酸測序，測序結(jié)果（圖3）為TTTATTAGGAGTGTGTGGGATGAATTATTTGCTCACTACCC，具有非常好的重現(xiàn)性。

2.3 焦磷酸測序目標(biāo)序列同源性分析 對測序結(jié)果在genbank中進(jìn)行同源性比對，結(jié)果（圖4）表明目標(biāo)序列與大豆過敏原GlymBd 30K基因（P34）聚為一簇，能夠作為鑒定GlymBd 30K基因很好的序列。

3 結(jié)論

該研究建立的焦磷酸測序技術(shù)吸收了PCR和DNA測序技術(shù)兩方面的優(yōu)勢，在PCR特異性的基礎(chǔ)上，應(yīng)用很短的一段保守/特異序列的測定即可滿足檢測的需要。

該研究對豆科植物和13個進(jìn)境大豆樣品進(jìn)行了PCR特異性擴(kuò)增和焦磷酸測序研究，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增具有特異性，所建立大豆過敏原基因Glym Bd 30K焦磷酸測序方法能夠快速對目的基因進(jìn)行測序，尚未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，具有較高的特異性。該方法具有快速、穩(wěn)定性好、靈敏、特異高的特點(diǎn)。焦磷酸測序技術(shù)作為一種短片段測序方法，操作簡單方便，可程序化，能夠很好地保證測序結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，另外該方法檢測速度快，40 min內(nèi)即可準(zhǔn)確、實(shí)時地測定出96個樣品目的片段的基因序列，可滿足快速檢測的需求，具有不可替代的作用。

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