董杰

1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

抗原采用豬囊尾蚴的囊液，經(jīng)親和層析純化、濃縮、分裝后，于-20℃保存，使用前，用0.1M pH值9.6醋酸鹽緩沖液稀釋，使蛋白含量為30毫克/分升.酶結(jié)合物用兔抗豬IgG免疫血清，經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀，再經(jīng)DEAE-纖維素純化提取免疫抗豬IgG抗體，用辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG，經(jīng)酶活力測定，應用時最適稀釋濃度為1∶1000。

操作方法為，以40孔聚苯乙烯微量反應為固相載體，每凹孔加稀釋抗原液0.2毫升，置于4℃冰箱過夜，或30℃2小時，用pH值7.4PBS-吐溫20洗滌3次，每次3分鐘，抽干，加以PBS-吐溫20稀釋的被檢血清0.2毫升，同份血清同同時試驗2孔，置于37℃水浴箱孵育30分鐘，同前洗滌，加1∶1000稀釋的酶結(jié)合物0.2毫升，37℃水浴箱孵育30分鐘，同前洗滌，加底物過氧化氫-鄰苯二胺溶液0.2毫升，37℃15分鐘后加2M硫酸0.05毫升終止反應。之后，將微量反應板移入酶標記光度計內(nèi)，于492納米波長測定光密度（OD值），每次試驗均設置陽性陰性參考血清和PBS-吐溫20空白對照。以參考陽性血清的OD值作0.1.待測血清的OD值大于或等于陽性參考血清的OD值時為陽性，低于此值為陰性。陽性豬反應液呈鮮明的橙黃色，陰性豬反應液呈淺的淡黃色，兩者眼觀對比有明顯差別，易于判定。經(jīng)反復試驗，選定抗原的稀釋度為30微克/毫升，血清稀釋度為1∶50。

間接血凝集試驗是一種敏感度很高的血清學試驗，在豬囊尾蚴病的診斷上取得了很好的效果。從新鮮的豬囊尾蚴豬肉剝離整個蟲體，吸取囊液混合后離心沉淀，取上清液即為囊尾蚴液抗原。用2.5%戊二醛處理過的2.5%鞣酸化羊紅細胞與等量稀釋的囊尾蚴液抗原混合，于37℃水浴中攪拌30分鐘，離心去上清液，磷酸鹽緩沖液洗3次，再懸浮于含2%滅活兔血清的磷酸鹽緩沖液中，制成1%羊紅細胞懸濁液即為致敏羊紅細胞，4℃保存?zhèn)溆?。?.5%鞣酸化羊紅細胞離心去上清液，用含2%滅活兔血清的磷酸鹽緩沖液制成1%羊紅細胞懸液，作為對照羊紅細胞，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取受檢血清0.05毫升，加9倍量的對照羊紅細胞放室溫10分鐘，以吸收嗜異性抗體。離心沉淀后，取上清液，即為1∶10受檢血清，再用磷酸鹽緩沖液稀釋為1∶50。每份受檢的稀釋血清，用9支試管作2倍遞減稀釋：向1、2、9三支試管內(nèi)各加入上述稀釋血清0.1毫升，向2～8管各加入磷酸鹽緩沖液0.1毫升，從第2管吸出0.1毫升放入第3管，同法依次稀釋至第8管，最后從第八管吸出0.1毫升棄去，使1～8管分別含1∶50，1∶100，1∶200，……1∶6400的稀釋血清0.1毫升，第9管作為血清對照管。第1～8管加致敏羊紅細胞1滴（0.05～0.06毫升），第9管加對照羊紅細胞1滴，充分混勻后，放置室溫內(nèi)靜置2～3小時，待紅細胞完全沉淀后記錄結(jié)果。

效價測定：依凝集程度分為0，0.25，0.50，0.75和100%共5個等級，分別以0、1、2、3、4數(shù)字代替。管底出現(xiàn)均勻緊密的顆粒性凝集、細邊，紅細胞沉集范圍小于管底直徑的2/3而仍大于1/2，即為3級凝集；若只有少量凝集，但邊緣加粗，紅細胞沉集范圍等于管底直徑的1/2者為2級凝集；同上，但其紅細胞沉集范圍小于管底直徑的1/2者，為1級凝集；完全不凝集，管底中心呈清楚的暗紅鈕狀者為0級。凡受檢血清稀釋1∶50或更大，仍發(fā)生超2級反應者確定為囊尾蚴病間接血凝試驗陽性，而對照均應為陰性，否則應當重做。

2 環(huán)狀沉淀反應

用新鮮的豬囊尾蚴經(jīng)過丙酮、乙醚的處理，取其干燥的蟲粉以生理鹽水浸漬24小時后，經(jīng)細菌濾斗過濾所制備的抗原，稀釋到4000倍具有診斷價值，但陽性反應的滴度可高達3200倍。

為提高抗原的特異性，除了注意和防止可能出現(xiàn)的某些非特異性干擾因素外，進行了硫酸銨分層和熒光分析，其方法是將新鮮豬囊尾蚴的全蟲置于熒光燈的暗室，在紫外光的照射下發(fā)出明亮的紅色熒光。如分成頭節(jié)、囊液和囊膜3部分，分別進行熒光檢查，則只有囊液可以觀察到明亮的熒光物質(zhì)。為了從囊液中提取此熒光物質(zhì)，用酒精混于囊液中，可將此物同蛋白質(zhì)一樣沉淀出來，取此沉淀物再進行熒光檢查，可見強烈的熒光。再將此有強烈熒光的沉淀物用各種不同的飽和程度的硫酸銨進行分層，析出不同的沉淀，再作紫外熒光的比較分析。