檀磊

【摘 要】人工授精是發(fā)揮優(yōu)秀公畜遺傳潛力的重要現(xiàn)代動(dòng)物生物技術(shù)，而冷凍精液正是為了提供人工授精所需精子產(chǎn)品的一種精子庫(kù)。由卵黃、蔗糖、檸檬酸鈉、甘油和抑菌物質(zhì)所組成的稀釋液對(duì)精子起到一定的保護(hù)作用。但是，在精子的冷凍-解凍過(guò)程中，容易發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致精液品質(zhì)下降。本研究在用卵黃、蔗糖、檸檬酸鈉、甘油和抑菌物質(zhì)配制好的精液稀釋液里面分別添加0.00%（對(duì)照）、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的VB12進(jìn)行試驗(yàn)，解凍后評(píng)定精子運(yùn)動(dòng)特性、精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性等指標(biāo)。結(jié)果表明：稀釋液中添加0.50%維生素B12效果最好，其精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性等明顯高于其他組（P<0.01）。

【關(guān)鍵詞】奶牛；冷凍精液；維生素B12；精液品質(zhì)

0.前言

人工授精技術(shù)和冷凍精液的應(yīng)用極大的推動(dòng)了畜牧業(yè)的發(fā)展和良種的推廣?，F(xiàn)在冷凍精液制造技術(shù)也日漸成熟，凍精品質(zhì)得到了很大的提高，冷凍精液已經(jīng)成了現(xiàn)在養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)所不可缺少的部分，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。但是精液在冷凍—解凍過(guò)程中還是不可避免的會(huì)與活性氧化物接觸，致使精子發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，冷凍精液的品質(zhì)降低。本試驗(yàn)添加不同量的維生素B12，利用偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)，檢測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)特性，同時(shí)檢測(cè)精子頂體完整率和質(zhì)膜完整性，精確的分析精液品質(zhì)，為現(xiàn)代化冷凍精液生產(chǎn)提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物用陜西省家畜改良站飼養(yǎng)的成年、體質(zhì)健康、性欲旺盛、采精頻率正常的荷斯坦公牛，并且每次試驗(yàn)從飼養(yǎng)的所有荷斯坦奶牛所采的精液隨機(jī)取用一頭牛的精液實(shí)驗(yàn)。

1.2精液稀釋液的配制

每種類型稀釋液配制100ml，所需要加入的各種試劑量，如表1所示

1.3 精液的冷凍前處理

1.3.1 精液稀釋

試驗(yàn)采用一步稀釋法對(duì)精液進(jìn)行稀釋。在稀釋精液前要將稀釋液放在水浴箱中預(yù)熱，使稀釋液溫度保持在32-35℃，這樣加入精液之后精子受的損傷會(huì)減小。

試驗(yàn)中一般將精液密度保持在1.5x108/ml左右，不應(yīng)過(guò)高，這樣有利于解凍后精子活力的檢測(cè)。

1.3.2精液分裝

把稀釋好的精液送到精液分裝的地方，利用全自動(dòng)精子細(xì)管分裝儀進(jìn)行裝管，封口，印號(hào)，并應(yīng)該把裝好的細(xì)管及時(shí)地放進(jìn)恒溫平衡儀。

1.3.3精液平衡

精液在冷凍過(guò)程中冰晶化過(guò)程對(duì)精子的損傷最為嚴(yán)重，精液平衡的目的是為了讓精液的溫度緩慢的下降到始凍溫度并且讓甘油充分的進(jìn)入精子細(xì)胞，起到甘油的抗凍保護(hù)作用，因此平衡的好壞直接影響冷凍過(guò)程中冰晶化過(guò)程對(duì)精子的傷害。在精液自動(dòng)平衡儀中，溫度設(shè)定為4℃，儀器蓋好放置3h讓精液的溫度由室溫緩慢的降到4℃，為精液的冷凍保存作好準(zhǔn)備。

1.4 精液冷凍和解凍

1.4.1精液冷凍

精液冷凍時(shí)主要是在0到-15℃這一過(guò)程的冰晶化過(guò)程對(duì)精子的傷害，因而冷凍過(guò)程中應(yīng)該極力避免這一過(guò)程，讓這一過(guò)程的時(shí)間盡量的縮短。本試驗(yàn)所用的全自動(dòng)冷凍儀從4℃開始冷凍，能夠在7′12″內(nèi)把溫度降低到-140℃，這樣就極大地縮短了冰晶化過(guò)程的時(shí)間，使精液的傷害降到最小。冷凍好的精液應(yīng)該迅速的從冷凍儀里面取出來(lái)用小布袋進(jìn)行分裝，并且迅速的浸泡在液氮中保存。

1.4.2精液解凍

本試驗(yàn)采用37.8℃的水溫進(jìn)行解凍30s，從液氮罐中迅速的取出里面冷凍好的細(xì)管，并且快速的投入到水中進(jìn)行解凍，整個(gè)過(guò)程必須迅速完成。解凍好的細(xì)管拿出來(lái)用干凈的紗布擦干，等待檢查。

1.5凍后精液品質(zhì)檢查

1.5.1精子運(yùn)動(dòng)特性檢查

利用偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)可以得到精子的運(yùn)動(dòng)特性，包括直線運(yùn)動(dòng)速度、曲線速度、平均路徑速度、鞭打頻率、側(cè)擺幅度。并且能夠得到a級(jí)、b級(jí)、c級(jí)、d級(jí)精子數(shù)和所占的百分率（a級(jí)精子為快速前向運(yùn)動(dòng)精子、b級(jí)精子為慢速前向運(yùn)動(dòng)精子、c級(jí)精子為非前向運(yùn)動(dòng)精子、d級(jí)精子為不動(dòng)精子）。這些數(shù)據(jù)可以很好的描述精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，為精確分析精液的品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1.5.2精子活力的測(cè)定

采用平板壓片法，取一滴精液（10μl）于預(yù)熱（38℃）的載玻片上，蓋上蓋玻片，400倍下鏡檢，估測(cè)活力。也可以利用計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)以得出比較準(zhǔn)確的數(shù)值。

1.5.3 頂體完整率的檢查

配制姬姆薩染液并且染色制片（染液配制和制片方法見附錄），在相差顯微鏡1000倍鏡下隨機(jī)計(jì)算5個(gè)視野的精子，計(jì)算頂體完整率。

頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/總精子數(shù)

1.5.4 質(zhì)膜完整性的檢查

采用低滲腫脹法，取50μl精液加入1ml低滲液（37℃預(yù)熱）中，37℃恒溫水浴30min。取一滴（20μl）混合液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，40X下觀察5個(gè)視野，鏡檢計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算彎尾精子的百分率（精子質(zhì)膜如果是完整的話精子的通透性比較好，這樣液體滲入精子會(huì)卷尾）。

質(zhì)膜完整率（%）=彎尾精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

1.6數(shù)據(jù)處理

論文所得數(shù)據(jù)全部用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析。

2.結(jié)果與分析

2.1精子運(yùn)動(dòng)特性測(cè)定結(jié)果

通過(guò)偉力彩色精子質(zhì)量分析檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定精子的運(yùn)動(dòng)特性，用試驗(yàn)做好的細(xì)管冷凍精液，隨機(jī)抽取解凍10支細(xì)管作為重復(fù)，觀測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)特性，試驗(yàn)結(jié)果如表2和表3所示。

對(duì)于解凍精液中精子的運(yùn)動(dòng)情況，以及各種運(yùn)動(dòng)類型精子所占的比率，得到如表3所示得數(shù)據(jù)。

由表2可知，0.5%組精子的運(yùn)動(dòng)速度包括直線速度、曲線速度、平均路徑速度這些都明顯高于其他幾組。與對(duì)照組相比0.5%組高于對(duì)照組（P<0.01），0.75%組也高于對(duì)照組（P<0.05），0.25%組和對(duì)照組沒(méi)有明顯的差別，但是1%組的效果明顯降低，低于對(duì)照組。側(cè)擺幅度各組沒(méi)有明顯的差別。鞭打頻率0.5%組和0.75%組低于對(duì)照組，0.25%組和對(duì)照沒(méi)有明顯的差別，1%組高于對(duì)照組。

由表3可知，精子的運(yùn)動(dòng)情況，其中a類型和b類型的精子數(shù)量越多，占的比例越大，則就說(shuō)明精子的活力越高。試驗(yàn)中添加了0.5%組維生素B12的冷凍精液其a+b類型的精子比率明顯高于對(duì)照組（P<0.01），而0.75%組也高于對(duì)照組（P<0.05），1%組低于對(duì)照組（P<0.05），0.25%組和對(duì)照組沒(méi)有明顯差別，由此證明了0.5%的添加量為最合適的添加量。

2.2精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性的測(cè)定結(jié)果

添加不同濃度維生素B12的稀釋液對(duì)牛冷凍精液精子活力，頂體完整率，質(zhì)膜完整性均有不同的影響，試驗(yàn)各組的精子活力均高于30%達(dá)到了人工授精的標(biāo)準(zhǔn)，但是與對(duì)照組相比較。如下表4、表5和表6所示：

試驗(yàn)隨機(jī)用3頭牛的精液進(jìn)行試驗(yàn)，每次做5個(gè)重復(fù)。

上面的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，0.5%組精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性，均遠(yuǎn)高于對(duì)照組，差異極顯著（P<0.01）。而0.75%組其精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性，也均高于對(duì)照組，差異顯著（P<0.05）。0.25%組和對(duì)照組沒(méi)有明顯的區(qū)別，差異不顯著，1%組的各個(gè)方面都低于對(duì)照組差異不顯著（P）0.05）。因此，0.5%的維生素B12添加量是最佳添加量，這和蔡吉光等人的研究結(jié)論一致。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明精子的活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整率具有很高的相關(guān)性[14]。只有頂體完整的精子才具有活力，質(zhì)膜也才可能完整。因而頂體完整率高于精子活力和質(zhì)膜完整性。一般質(zhì)膜完整性低于精子活力，因?yàn)橛行┵|(zhì)膜不完整的精子在短時(shí)間內(nèi)也具有活性。

3.討論和結(jié)論

3.1關(guān)于維生素B12在冷凍精液稀釋液中保護(hù)作用機(jī)理

精液在冷凍過(guò)程中受到的傷害主要來(lái)源于兩個(gè)方面，其一是精液在冷凍—解凍過(guò)程中的冰晶化過(guò)程所帶來(lái)的不可逆的損傷。另一方面就是精子受到環(huán)境和精液中的活性氧化物的作用而發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致活力下降，精子畸形率等增加。

維生素B12又名鈷胺素，是含有金屬元素鈷的一類化合物，其生理活性在很大程度上取決于鈷，鈷能夠減少組織的耗氧量，從而提高機(jī)體對(duì)氧的耐受性，增加機(jī)體組織在缺氧環(huán)境中的活力。它在精液稀釋液中的保護(hù)機(jī)理目前研究還不很清楚，但研究者們都認(rèn)為維生素B12的保護(hù)作用機(jī)理是：

維生素B12作牛的精液稀釋液可以提高解凍后的精子活力，一般認(rèn)為，維生素B12的這一作用與其輔酶活性有關(guān)，維生素B12輔酶能使“氧化型（-S-S-型）輔酶A”還原成“還原型（-SH-型）輔酶A”，也可使-S-S- 型谷胱甘肽（glutathione，GSH）以及高胱氨酸還原為-SH型，而還原型的GSH對(duì)精細(xì)胞的代謝有非常重要的生物學(xué)活性；也有研究者發(fā)現(xiàn)，含維生素B12精清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）釋放量明顯下降，認(rèn)為這可能是提高精子活力的一個(gè)重要因素，因?yàn)樵诶鋬龊徒鈨鲞^(guò)程中，精子中的GOT就會(huì)釋放出來(lái)，從而導(dǎo)致精子的頂體腫脹和損壞，這一點(diǎn)能夠提高解凍后精子的頂體完整率，同時(shí)精子的畸形率也有明顯下降。

3.2關(guān)于冷凍-解凍后精液品質(zhì)

到目前為止，已經(jīng)有很多人試驗(yàn)過(guò)在牛精液稀釋液里面添加維生素B12提高冷凍精液品質(zhì)的研究。本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，稀釋液中添加維生素B12在精子運(yùn)動(dòng)特性、精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性這些方面都取的了較好的效果。并且研究最佳的添加量為0.5%（V/V），精子活力達(dá)到了53%，高于蔡吉光等的報(bào)道數(shù)據(jù)。

哺乳動(dòng)物射出的精液不能馬上使卵子受精，精子必須在雌性動(dòng)物的生殖道內(nèi)“獲能”后，才具備授精能力。在精-卵受精時(shí)，精子要穿過(guò)透明帶，發(fā)生頂體反應(yīng)，因此精子頂體的完整非常重要，為了有效的計(jì)算頂體完整率，本試驗(yàn)采用姬姆薩染液染色后在顯微鏡下檢測(cè)，染色后的精子在顯微鏡下觀察非常清楚，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)在顯微鏡的不同視野里面數(shù)200個(gè)精子，然后計(jì)算頂體完整率。試驗(yàn)頂體完整率達(dá)到了67%，與孫淑琴等人的研究結(jié)果十分接近。

為了評(píng)估冷凍-解凍后精子質(zhì)膜的完整性，本研究采用低滲膨脹試驗(yàn)（HOST）進(jìn)行檢測(cè)。HOST原理是，質(zhì)膜完整的精（下轉(zhuǎn)第184頁(yè)）（上接第127頁(yè)）子在低滲溶液中由于滲透作用而發(fā)生膨脹，從而表現(xiàn)出卷尾狀態(tài)。水分由于滲透作用通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，重新構(gòu)建了細(xì)胞內(nèi)原有體液和細(xì)胞外液體之間的平衡體系。細(xì)胞體積增大，細(xì)胞膜擴(kuò)張，引起鞭毛的卷曲。如果精子的質(zhì)膜破損，則精子不能發(fā)生膨脹，也就不可能出現(xiàn)卷尾現(xiàn)象。在應(yīng)用低滲腫脹試驗(yàn)檢測(cè)精子質(zhì)膜完整性時(shí)，HOST溶液的滲透壓應(yīng)足夠低，既能最大限度的使精子質(zhì)膜發(fā)生腫脹但又不能溶解精子細(xì)胞膜。在本研究中，溶液的滲透壓為 150mOsm/kg H2O，此時(shí)冷凍-解凍后精子質(zhì)膜的完整率達(dá)到 51%，取得了理想的效果。

利用偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)得到的精子運(yùn)動(dòng)特性，也充分的說(shuō)明了0.5%維生素添加量是最合適的。通過(guò)精子的運(yùn)動(dòng)特征我們可以知道，精子的運(yùn)動(dòng)速度，運(yùn)動(dòng)方向和精子的活力具有很高的相關(guān)性，同時(shí)鞭打頻率和側(cè)擺幅度也和活力相關(guān)。向前運(yùn)動(dòng)精子比例高，精子運(yùn)動(dòng)速度快就表明精子活力高。同時(shí)各種運(yùn)動(dòng)精子側(cè)擺幅度基本相同沒(méi)有明顯的差異，而活力高的精子，在運(yùn)動(dòng)時(shí)鞭毛的擺動(dòng)次數(shù)就少，而活力低的精子在運(yùn)動(dòng)時(shí)要耗費(fèi)更多的能量，其鞭毛的擺動(dòng)頻率就快。

4.小結(jié)

本試驗(yàn)在由卵黃、蔗糖、檸檬酸鈉、甘油和抑菌物質(zhì)配制好的精液稀釋液里面分別添加0.00%（對(duì)照）、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%的VB12進(jìn)行試驗(yàn)，解凍后評(píng)定精子運(yùn)動(dòng)特性、精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性等指標(biāo)，并用這些指標(biāo)來(lái)評(píng)定精液品質(zhì)。結(jié)果表明：在基礎(chǔ)稀釋液中添加0.50%維生素B12效果最好，其在精子運(yùn)動(dòng)特性、精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整性這些指標(biāo)上都明顯高于其他組（P<0.01）。試驗(yàn)研究的成功給實(shí)際生產(chǎn)冷凍精液提供數(shù)字依據(jù)，對(duì)我國(guó)的冷凍精液品質(zhì)提高起到很大的推動(dòng)作用，也為我國(guó)畜牧的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。 [科]