王蓉等

摘要

[目的]對從紫海膽腸道分離得到的曲霉菌（Aspergillus sp.）菌株HDf2進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物研究。[方法]采用液體發(fā)酵，運用柱層析方法從培養(yǎng)液中分離、純化單體化合物。[結(jié)果]從乙酸乙酯提取物較高極性段分離得到1個單體化合物，通過波譜解析和與文獻(xiàn)對照將其鑒定為nonadride類化合物glauconic acid。[結(jié)論]該研究首次報道了海洋來源的真菌產(chǎn)天然界稀有的nonadride類天然化合物glauconic acid。

關(guān)鍵詞紫海膽；曲霉菌；海洋真菌；nonadride

中圖分類號S917.1；O629.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）21-001-02

海洋微生物是尋找結(jié)構(gòu)新穎分子的一個新源泉。通過對海洋微生物的次生代謝天然產(chǎn)物研究，發(fā)現(xiàn)許多具有生物活性的結(jié)構(gòu)新穎化合物[1]。海洋真菌常與海洋生物形成共生。獨特的生存環(huán)境使其能夠產(chǎn)生眾多結(jié)構(gòu)多樣的活性天然產(chǎn)物，諸如抗菌、抗腫瘤、抗污損的萜類、生物堿類天然化合物[2-5]。近年來，筆者對來自南中國海紫海膽的腸道真菌曲霉菌（Aspergillus sp.）菌株HDf2 的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)的研究，從中分離、鑒定出一系列具有抗菌、抗污損活性的新型刺孢青霉素類化合物[6-8]。為充分挖掘該菌產(chǎn)結(jié)構(gòu)新穎性分子的潛力，依據(jù)OSMAC（one strainmany compounds）策略[9]，筆者通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基對該菌進(jìn)行發(fā)酵，從其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中分離得到化合物1，通過波譜解析和與文獻(xiàn)對照鑒定為天然界稀有的nonadride類化合物glauconic acid。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

儀器與試劑。高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Agilent 6210 TOF LCMS質(zhì)譜儀測定；化合物1D和2D譜圖由Bruker Avance III500核磁共振波譜儀測定，以TMS為內(nèi)標(biāo)；薄層層析硅膠（GF254）和層析柱硅膠（200～300目）均為青島海洋化工廠出品；Sephadex LH20和ODS反相硅膠分別購自瑞士GE Healthcare BioSciences 和日本YMC公司；HPLC試驗中使用色譜試劑購自美國Tedia Company Inc.，其余試劑均為分析純。

1.1.2

培養(yǎng)基。真菌培養(yǎng)與發(fā)酵用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）平板，組成為：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂條20 g、水1 000 ml。將馬鈴薯切小塊，沸水煮30 min后過濾、定容、分裝滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基為液體PDA。

1.1.3

菌株。曲霉菌菌株HDf2是由筆者從南中國海海岸采集的紫海膽中分離得到的[8]。

1.2方法

1.2.1

菌株的發(fā)酵。曲霉菌菌株HDf2經(jīng)PDA平板活化，28 ℃暗培養(yǎng)7 d。取菌塊直接接種于液體PDA培養(yǎng)基中，每瓶液體培養(yǎng)基450 ml，共接種20瓶Erlenmeyer燒瓶（1 000 ml），于三層搖床上培養(yǎng)2周（120 r/min，28 ℃）。

1.2.2

化合物的分離與純化。過濾發(fā)酵物后得約9 L發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)等體積的乙酸乙酯萃取3遍，經(jīng)減壓濃縮得粗提物2.8 g。該粗膏經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇梯度洗脫得到6個流份（V/V， 100∶0、100∶1、100∶2、100∶4， 100∶8， 0∶100）。其中，流份4（氯仿-甲醇，100∶4）經(jīng)C18 ODS反相硅膠柱層析，以甲醇-水梯度洗脫得到6個流份（V/V， 50∶50、60∶40、70∶30、75∶25、85∶15、100∶0）；流份1（甲醇-水，50∶50）經(jīng)Sephadex LH20凝膠柱層析（甲醇為流動相）和HPLC（甲醇-水，75∶25，加濃度0.1% TFA），得到化合物1 （glauconic acid，2.4 mg， tR=10.1 min）。

2 結(jié)果與分析

化合物1無色結(jié)晶（甲醇），正源高分辨ESI質(zhì)譜顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 371.109 8 [M+Na]+，推出其分子式為C18H20O7，不飽和度為9。1HNMR、13CNMR結(jié)合DEPT譜可以看出，該化合物含有8個季碳、3個甲基、3個亞甲基和4個次甲基（其中1個次甲基連氧）。δC 177.3、169.9、166.0、165.9的季碳顯示分子中有4個酯羰基存在，推測分子中可能存在2個酸酐。δC 151.0的次甲基和δC 150.8、133.4、131.3的季碳提示分子中有2個雙鍵存在。分子中剩余的不飽和度表明還存在3個環(huán)。進(jìn)一步分析該化合物分子式，發(fā)現(xiàn)除去4個酯羰基氧和1個連次甲基氧，還剩2個氧，可能每個氧與酯羰基各形成1個五元酸酐環(huán)，因此分子中還存在一個環(huán)。通過HSQC譜，可判斷該化合物中碳上所連接的質(zhì)子情況。分析1HNMR譜，δ 0.87和1.09為2個三重峰，13CNMR和DEPT135譜中存在2個甲基和2個亞甲基，推斷分子中存在2條乙基鏈。1H1H COSY譜相關(guān)信號（圖1）可清楚證實上述推斷，并揭示分子部分結(jié)構(gòu)片段：H1與H2，H2與H2，H2同時與H3和H1，H1同時與H9和H4，以及H4與H3相關(guān)，表明該分子存在此結(jié)構(gòu)片段。進(jìn)一步分析HMBC譜相關(guān)信號，可揭示整個分子的結(jié)構(gòu)：H2與C4，H3與C4和C5，H6與C4、C5和C8，H5與C6、C7和C8以及H9與C7和C8存在相關(guān)，表明該分子中存在1個九元環(huán)結(jié)構(gòu)；H3與C10、H6與C11、H9與C13和H5與C12的HMBC相關(guān)證實分子中2個五元酸酐環(huán)的位置。通過將上述結(jié)構(gòu)片段連接整理，即可得到化合物1的平面結(jié)構(gòu)（圖1）。該化合物的相對構(gòu)型通過ROESY試驗得到確定。H2與H3存在noe相關(guān)，表明其處于同一平面；H1同時與H2和H5 存在noe相關(guān)，表明其同處于另一平面，從而確定化合物1的相對構(gòu)型。該化合物的1H和13CNMR數(shù)據(jù)歸屬如下：1HNMR （CD3OD， 500 MHz），δ 0.87 （3H， t， J = 7.5 Hz， H3）， 1.09 （3H， t， J = 7.5 Hz， H1）， 139 （3H， s， H5）， 1.57 （1H， m， H2b） ， 1.59 （1H， m， H4b）， 1.66 （1H， m， H4a）， 1.70 （1H， m， H2a）， 2.38 （1H， m， H2）， 2.47 （1H， m， H1）， 2.85 （1H， d， J = 14.0 Hz， H6b）， 3.28 （1H， d， J = 14.0 Hz， H6a）， 4.21 （1H， d， J = 10.5 Hz， H3）， 6.98 （1H， d， J = 12.0 Hz， H9）； 13CNMR （CD3OD， 125 MHz），δ 13.1 （q， C3）， 15.2 （q， C1）， 20.4 （q， C5）， 21.0 （t， C2）， 27.7 （t， C4）， 35.9 （t， C6）， 43.8 （d， C1）， 50.1 （s， C7）， 52.6 （d， C2）， 74.3 （d， C3）， 131.3 （s， C5）， 133.4 （s， C8）， 150.8 （s， C4）， 151.0 （d， C9）， 165.9 （s， C13）， 166.0 （s， C11）， 169.9 （s， C10）， 177.3 （s， C12）。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值[10]基本一致，確定化合物1為glauconic acid。該化合物屬于nonadride類化合物，在天然界很少發(fā)現(xiàn)。它結(jié)構(gòu)新穎，多具有獨特的藥理活性[11-13]。

參考文獻(xiàn)

[1]

KIURU P，D′AURIA M V，MULLER C D，et al.Exploring marine resources for bioactive compounds[J].Planta Med，2014，80（14）：1234-1246.

[2] HAGA A，TAMOTO H，ISHINO M，et al.Pyridone alkaloids from a marinederived fungus，Stagonosporopsis cucurbitacearum，and their activities against azoleresistant Candida albicans[J].J Nat Prod，2013，76（4）：750-754.

[3] KOCH L，LODIN A，HEROLD I，et al.Sensitivity of Neurospora crassa to a marinederived Aspergillus tubingensis anhydride exhibiting antifungal activity that is mediated by the MAS1 protein[J].Mar Drugs，2014，12（9）：4713-4731.

[4] LIAO L J，LEE J H，YOU M J，et al.Penicillipyrones A and B，meroterpenoids from a marinederived Penicillium sp. fungus[J].J Nat Prod，2014，77（2）：406-410.

[5] WU Z H，LIU D，PROKSCH P，et al.Punctaporonins HM：Caryophyllenetype sesquiterpenoids from the spongeassociated fungus Hansfordia sinuosae[J].Mar Drugs，2014，12（7）：3904-3916.

[6] WANG R，F(xiàn)U Z D，HE X N，et al.New secondary metabolites produced by the marinederived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Chin J Tropical Crops，2014，35（8）：1658-1662.

[7] WANG R，HE H，ZHAN X F，et al.Antifouling secondary metabolites from the sea urchinassociated fungus Aspergillus sp.HDf2[J].J Anhui Agric Sci，2014，42（25）：8492-8493.

[8] WANG R，LIU T M，SHEN M H，et al.Spiculisporic acids BD，three new γbutenolide derivatives from a sea urchinderived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Molecules，2012，17：13175-13182.

[9] HEWAGE R T，AREE T，MAHIDOL C，et al.One strainmany compounds （OSMAC） method for production of polyketides，azaphilones，and an isochromanone using the endophytic fungus Dothideomycete sp.[J].Phytochemistry，2014，108：87-94.

[10] NIEMINEN S，TAMM C.1Hund 13CNMR.spektroskopie der nonadride[J].Helv Chim Acta，1981，64（8）：2791-2801.

[11] SPENCER P，AGNELLI F，WILLIAMS H J，et al.Biosynthetic studies on the fungal secondary metabolites CP225 917 and CP263 114[J].J Am Chem Soc，2000，122：420-421.

[12] WHITE J D，KIM J，DRAPELA N E.Enantiospecific synthesis of （+）byssochlamic acid，a nonadride from the ascomycete Byssochlamys fulva[J].J Am Chem Soc，2000，122：8665-8671.

[13] CHEN X L，ZHENG Y G，SHEN Y C.Natural products with maleic anhydride structure：nonadrides，tautomycin，chaetomellic anhydride，and other compounds[J].Chem Rev，2007，107（5）：1777-1830.