林艷君 賴鐘雄

摘 要 以鐵皮石斛原球莖為材料，采用同源克隆的方法，成功得到了鐵皮石斛Do-HDR基因的全長，并通過qPCR對其相對表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：Do-HDR基因全長1 784 bp（GenBank登錄號KJ946381），5′UTR為40 bp，3′UTR為361 bp，開放閱讀框為1 382 bp，編碼460個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白為穩(wěn)定的親水蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，不含信號肽，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。采用滅活的尖孢鐮刀菌菌液作為誘導(dǎo)子，分別以0、100、200、500、1 000 mg/L的濃度培養(yǎng)3 d后測定總生物堿含量，結(jié)果表明，總生物堿含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；當(dāng)誘導(dǎo)子濃度為200 mg/L時，總生物堿含量達(dá)到最大值。在此基礎(chǔ)上通過qPCR分析Do-HDR基因的相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Do-HDR基因相對表達(dá)量在誘導(dǎo)子濃度為200 mg/L時也到達(dá)最大值。因此，推測Do-HDR基因與生物堿的合成與積累有關(guān)。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；Do-HDR基因；基因克?。籷PCR；生物堿

中圖分類號 S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是一味珍貴的藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品，味甘平，具有補(bǔ)五臟虛勞、羸瘦、強(qiáng)陰的功效，久服厚腸胃，輕身延年，有益胃生津、滋陰清熱的功效[1]。大量研究結(jié)果表明，鐵皮石斛對腫瘤、眼科疾病、腸胃疾病、糖尿病等有一定的作用[2-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，鐵皮石斛主要藥用成分有多糖、菲類、聯(lián)芐母核類、氨基酸、生物堿類等[5-6]。其中生物堿是最早被分離鑒定的物質(zhì)，而石斛堿型生物堿是鐵皮石斛生物堿中最主要的組分，具有保護(hù)神經(jīng)元、止痛退燒、保護(hù)胃腸道等作用，且對阿耳茨海默氏病具有一定的作用[7-9]。1964年犬伏康夫等確定石斛堿具有倍半萜骨架結(jié)構(gòu)，而石斛堿型生物堿的倍半萜骨架通過萜類化合物的生物合成途徑合成。長期以來，以甲羥戊酸為前體的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway， MVA pathway）被認(rèn)為是萜類合成的唯一途徑，直到20世紀(jì)90年代，法國學(xué)者Rohmer等[10]提出一條新的途徑-甲基赤蘚糖磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑。有研究結(jié)果認(rèn)為倍半萜、三萜通過傳統(tǒng)的MVA途徑合成，而單萜、雙萜、四聚類萜烯則通過MEP途徑合成[11]，但也有研究結(jié)果表明，倍半萜可經(jīng)由MEP途徑合成[12-13]，萜類合成的2條途徑并非孤立的存在，而是共同提供萜類合成所需的前體物質(zhì)IPP和DMAPP，在擬南芥[14]、煙草[15]中均發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象，但2條途徑在萜類物質(zhì)合成的過程中各自做出多少貢獻(xiàn)還不清楚。4-羥基-3-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸還原酶（4-hydroxy-3-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase. HDR）是MEP途徑中的最后一個酶，該酶催化HMBPP生成IPP和DMAPP。在銀杏[16]、擬南芥[17]、丹參[18]等多種植物中已經(jīng)克隆得到了HDR基因，但鐵皮石斛中的HDR基因研究仍未見報道。本研究通過同源克隆和RACE相結(jié)合的方法，獲得Do-HDR基因的全長，在真菌誘導(dǎo)子處理后測定其生物堿含量的變化，并通過qPCR分析其相對表達(dá)量，以期對鐵皮石斛生物堿合成與積累的分子機(jī)制研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）原球莖，產(chǎn)地為福建連城，2010年開始由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所繼代保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用Tripure法進(jìn)行總RNA的提取。利用Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物用于基因保守區(qū)、ORF及3′RACE的擴(kuò)增，5′RACE擴(kuò)增所用cDNA用Clotech試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 鐵皮石斛Do-HDR基因的引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增 （1）Do-HDR基因的保守區(qū)克隆。采用同源克隆的方法，利用反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對其目的片段進(jìn)行回收、連接、克隆、轉(zhuǎn)化、測序。各階段所有引物序列及退火溫度見表1。

（2）Do-HDR基因的3′端克隆。根據(jù)已經(jīng)得到的Do-HDR基因保守區(qū)序列，設(shè)計2條順式上游引物，以GeneRacerTM 3′Primer作為下游引物，以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，將第1輪產(chǎn)物稀釋10倍后作為第2輪擴(kuò)增的模板，下游引物為GeneRacerTM 3′Nestd Primer，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段，然后進(jìn)行連接、克隆、轉(zhuǎn)化、測序。

（3）Do-HDR基因的5′端克隆。方法同3端克隆，所用下游引物為UPM。

（4）Do-HDR基因的拼接驗證。在基因5′和端3′端設(shè)計引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并驗證cDNA拼接結(jié)果。

1.2.3 PCR參數(shù)設(shè)置 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，退火45 s（退火溫度根據(jù)不同擴(kuò)增片段Tm值設(shè)置），72 ℃延伸（延伸時間根據(jù)擴(kuò)增片段長度設(shè)定）。

1.2.4 真菌誘導(dǎo)子制備方法 參照Wang等[19]的方法，用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum，菌種由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院王永棟贈送）。采用苯酚硫酸法測定總糖含量，以總糖濃度標(biāo)定誘導(dǎo)子濃度。

1.2.5 樣品處理方法 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入50 g/L土豆煮沸，濾去土豆渣后土豆汁同培養(yǎng)基混合，白糖20 g/L，pH為5.4。分別加入0、100、200、500、1 000 mg/L尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為90 r/min。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間為12 h/d，光照強(qiáng)度為2 000 lx左右，培養(yǎng)3 d后收獲，所得樣品分別取0.2 g，提取總RNA后合成qPCR所用的cDNA，其余烘干備用。

1.2.6 不同濃度尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理下Do-HDR基因的qPCR 根據(jù)TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒的步驟反轉(zhuǎn)錄合成所需的cDNA。定量反應(yīng)所用的PCR反應(yīng)體系如下：SYBR 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，各個樣本cDNA 1 μL，加H2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)；40 ℃冷卻30 s。每個反應(yīng)重復(fù)3次，以18SrRNA為內(nèi)參基因，用相對定量法對目的基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。

1.2.7 總生物堿的測定 （1）樣品生物堿的提取。參考丁亞平等[20]的方法提取樣品的生物堿。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。采用酸性染料比色法測定總生物堿，具體步驟：精密稱取1.00 mg石斛堿對照品，用氯仿溶解后定容至100 mL。分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL石斛堿溶液加入60 mL分液漏斗，補(bǔ)充氯仿至體積為10 mL；然后加入5 mL鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉（pH4.5）及1.0 mL溴甲酚綠（0.04%）溶液，劇烈振蕩3 min，靜置30 min；再用氯仿并干燥的藥棉過濾氯仿層，取續(xù)濾液6 mL，加入0.01 mol/L氫氧化鈉無水乙醇溶液，搖勻后靜置備用。用未加石斛堿對照品的空白組做對照，在波長620 nm處分別測定吸光度。以稀釋后的石斛堿濃度為橫坐標(biāo)，樣品的吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）樣品生物堿的測定。取2 mL制備好的待測液，加入分液漏斗，補(bǔ)充氯仿至10 mL，其余步驟參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 Do-HDR基因序列全長的獲得

采用同源克隆的方法，以鐵皮石斛原球莖cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴(kuò)增得到Do-HDR基因的保守區(qū)，為一段383 bp的片段；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3′RACE和5′RACE，分別得到787 bp和789 bp的片段，與估計長度相符；利用DNAMAN6.0拼接序列，得到基因全長為1 784 bp。再設(shè)計1對引物驗證拼接結(jié)果，驗證片段長度為1 715 bp，與拼接結(jié)果相符并包含了完整的開放閱讀框，將該基因命名為Do-HDR，GenBank登錄號為KJ946381。測序結(jié)果顯示：Do-HDR基因5′UTR為40 bp，3′UTR為361 bp，Poly（A）尾巴僅為10 bp，開放閱讀框為1 382 bp，編碼460個氨基酸。

將拼接所得Do-HDR基因序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中與其他物種Blast比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因與其他HDR基因有比較高的同源性，與文心蘭的序列同源性達(dá)到89%，與毛果楊的序列同源性達(dá)到78%，與野茶樹的序列同源性達(dá)到77%，與喜樹的序列同源性達(dá)到77%。此外，用DNAMAN程序?qū)Ρ吐椤⒌?、蘿芙木、葡萄、玉米、長春花、文心蘭的氨基酸序列同筆者克隆所得鐵皮石斛氨基酸序列進(jìn)行多序列比對（圖1），結(jié)果表明，不同物種間的HDR基因氨基酸序列同源性很高。

將Do-HDR與GenBank中的15種植物的15種蛋白進(jìn)行比對，利用MEGA5.05構(gòu)建進(jìn)化樹，并分析聚類關(guān)系，結(jié)果見圖2，鐵皮石斛與蝴蝶蘭聚為一類，因此推測鐵皮石斛與蝴蝶蘭親緣關(guān)系最近。

2.2 生物信息學(xué)分析

利用ExPAsy Protparam在線預(yù)測理化性質(zhì)，Do-HDR所編碼的蛋白質(zhì)相對分子量為51 877.0，理論等電點為5.91，含量最高的氨基酸為賴氨酸（9.1%）、谷氨酸（8.5%）、纈氨酸（7.8%），HDR蛋白的平均疏水性為-0.412，屬于水溶性蛋白。SignalP 4.1 Server分析結(jié)果表明Do-HDR蛋白不含信號肽，不屬于分泌蛋白。PSORT工具分析結(jié)果表明，Do-HDR蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Tmhmm server v.2.0在線軟件預(yù)測HOR蛋白為膜外蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)。COILS分析結(jié)果表明，Do-HDR蛋白不含螺旋卷曲結(jié)構(gòu)。利用NetPhos 2.0 Server預(yù)測Do-HDR蛋白的磷酸化位點，結(jié)果表明，可能發(fā)生磷酸化的位點共有20個，其中有7個絲氨酸（Ser）磷酸化可能位點，蘇氨酸（Thr）7個，酪氨酸（Tyr）6個。

利用Protein Structure Prediction Server預(yù)測Do-HDR蛋白的二級結(jié)構(gòu)，該蛋白主要含有α-螺旋（36.7%）、β-折疊（17%）、無規(guī)則卷曲（46.3%），利用SWISS-MOSEL對Do-HDR蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，選用模板為4n7b.1，含有LytB保守結(jié)構(gòu)域，在此基礎(chǔ)上建立Do-HDR蛋白三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3，HDR蛋白含有大量的無規(guī)則卷曲，β-折疊較少，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合。

2.3 不同濃度尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理下鐵皮石斛原球莖生物堿含量的變化

不同濃度尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理3 d后鐵皮石斛原球莖生物堿含量的情況變化見圖4，添加誘導(dǎo)子的組別總生物堿含量均大于對照組；當(dāng)誘導(dǎo)子濃度為200 mg/L時效果最好，生物堿含量達(dá)到峰值；當(dāng)濃度繼續(xù)增大時，總生物堿含量開始下降，誘導(dǎo)子濃度達(dá)到1 000 mg/L時總生物堿含量與對照組相差無幾，由此可見，適宜濃度的尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子對促進(jìn)鐵皮石斛原球莖生物堿的積累與合成有促進(jìn)作用。

2.4 不同濃度尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理下鐵皮石斛Do-HDR基因相對表達(dá)量的變化

不同濃度尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理下鐵皮石斛Do-HDR基因相對表達(dá)量的變化見圖5，誘導(dǎo)子濃度為100 mg/L時，Do-HDR基因表達(dá)量略低于對照；誘導(dǎo)子濃度為200 mg/L時，Do-HDR基因的相對表達(dá)量急劇上升，達(dá)到最高值，為對照組的4.06倍；相應(yīng)的，此時總生物堿含量也達(dá)到最高值，而誘導(dǎo)子濃度繼續(xù)增大時Do-HDR 基因的表達(dá)水平開始下降，但相對表達(dá)量仍遠(yuǎn)高于對照組，相對表達(dá)量分別為對照組的2.11、2.50倍。

3 討論與結(jié)論

鐵皮石斛作為一種名貴中草藥，具有很高的藥用價值，其所含有的石斛堿是主要的藥用成分之一，但鐵皮石斛植株生長緩慢，野生資源匱乏，依靠野生資源無法滿足市場需求。而鐵皮石斛原球莖生長周期短，產(chǎn)量大，可實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，能夠作為石斛堿提取的原材料[21]。

3.1 真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)鐵皮石斛生物堿的合成和積累

植物能夠通過快速調(diào)控次生代謝途徑，產(chǎn)生特定的次生代謝物，在感染區(qū)域建立局部過敏反應(yīng)，從而抵擋微生物的入侵[22]。而真菌誘導(dǎo)子（fungal elicitor）在植物和微生物的互相作用中作為一種特定的化學(xué)信號，能夠通過誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，從而活化特定的代謝途徑，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的生成或者積累[23]。許多研究結(jié)果表明[24-25]，真菌誘導(dǎo)子對次生代謝產(chǎn)物的合成與積累有良好的促進(jìn)作用，本研究中運用尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理鐵皮石斛原球莖成功的提高了生物堿含量。張向飛等[26]的研究結(jié)果表明，鐮刀菌誘導(dǎo)子處理長春花愈傷組織16 h后，長春質(zhì)堿的含量能夠達(dá)到對照組的3倍多。文濤等[27]用黑曲霉誘導(dǎo)子處理使虎杖中白藜蘆醇的含量達(dá)到對照組的2.25倍。誘導(dǎo)子的濃度很大程度上影響了植物的次生代謝過程，高濃度的誘導(dǎo)子對植物的生長不利，而低濃度的誘導(dǎo)子又無法高效誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的生成[28]，本研究結(jié)果表明，當(dāng)尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子的濃度為200 mg/L時為最適濃度，生物堿含量最高。

3.2 Do-HDR基因可能參與調(diào)控鐵皮石斛生物堿的合成與積累

鐵皮石斛所含生物堿主要是具有倍半萜骨架的石斛堿，而倍半萜主要是通過甲羥戊酸途徑合成，而一些研究結(jié)果表明，倍半萜也通過甲基赤蘚糖磷酸途徑合成[29]，MEP途徑也提供合成倍半萜所需的前體物質(zhì)IPP和DMAPP，而HDR基因所編碼的酶是催化前體物質(zhì)合成IPP和DMAPP的直接物質(zhì)，HDR基因是合成萜類物質(zhì)的限速基因[30]。程琪慶等[31]的研究結(jié)果表明，SmHDR基因的相對表達(dá)量與丹參酮的含量呈正相關(guān)。在轉(zhuǎn)HDR基因的銀杏愈傷組織中，銀杏內(nèi)酯的含量顯著高于對照組，進(jìn)一步證明HDR基因?qū)祁惡铣傻闹匾訹32]。本實驗中，經(jīng)過尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理后。誘導(dǎo)子濃度為200 mg/L時總生物堿含量達(dá)到最高。熒光定量PCR的結(jié)果也表明，誘導(dǎo)子濃度為200 mg/L的組別Do-HDR基因相對表達(dá)量達(dá)到峰值，是對照組的4.06倍，之后開始下降，這一趨勢與各組別生物堿含量的趨勢大致相符，說明Do-HDR基因受尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)，并與生物堿含量相關(guān)，推測Do-HDR基因參與促進(jìn)鐵皮石斛生物堿的合成與積累。

植物的次生代謝是一個非常復(fù)雜的過程，下一步的研究重點可能放在克隆與分析參與鐵皮石斛生物堿合成途徑的基因和功能驗證上，為進(jìn)一步研究植物的次生代謝途徑提供更多的參考。

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