劉成等

摘要：為建立智利大麥染色體新的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記，用多聚核苷酸探針對中國春-智利大麥雙二倍體、1Hch和1HchS雜合附加系、4Hch、5Hch、6Hch和7Hch附加系進(jìn)行原位雜交（FISH）分析。以O(shè)ligo-pTa535.1和Oligo-pSc119.2進(jìn)行的雙色原位雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者能在1Hch～7Hch染色體上產(chǎn)生不同信號，而后者能在除3Hch外的6對染色體末端產(chǎn)生雜交信號；以（GAA）8進(jìn)行的單色原位雜交在智利大麥1Hch～7Hch染色體上的雜交信號也各不相同。以上3個探針在智利大麥染色體上的雜交信號和小麥染色體信號不同，并且在染色體轉(zhuǎn)移過程中未發(fā)現(xiàn)智利大麥多聚核苷酸序列明顯刪除現(xiàn)象。因此，可以用這3個探針進(jìn)行原位雜交對小麥背景中的智利大麥染色體進(jìn)行有效識別，并輔助利用智利大麥進(jìn)行小麥染色體工程育種工作。

關(guān)鍵詞：智利大麥；附加系；染色體；熒光；原位雜交；細(xì)胞遺傳標(biāo)記

中圖分類號：S512.303.53文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2015）05-0010-05

Fluorescence In Situ Hybridization Analysis

of Hordeum chilense Chromosomes

Liu Cheng， Gong Wenying， Li Haosheng， Liu Aifeng， Song Jianmin， Song Guoqi， Li Genying， Liu Jianjun*

（Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement in the

North Yellow-Huai River Valley， Ministry of Agriculture/National Engineering Laboratory for Wheat and Maize， Jinan 250100，China）

AbstractIn order to develop new cytogenetic markers specific for Hordeum chilense chromosomes， the Chinese Spring-H. chilense amphipliod， heterozygous 1Hch﹠1HchS additon， 4Hch， 5Hch， 6Hch and 7Hch additions were analyzed by fluorescence in situ hybridization （FISH） using Oligo-pTa535.1， Oligo-pSc119.2 and （GAA）8 as probes. The results of double-color FISH using Oligo-pTa535.1 and Oligo-pSc119.2 as probes showed that the individual 1Hch～7Hch chromosomes were painted by different signals except 3Hch chromosomes with Oligo-pSc119.2 probe； the FISH using （GAA）8 as probe suggested that most of subtelomeric and centromere regions of 1Hch～7Hch chromosomes were labeled by hybridization signals. The FISH signals of H. chilense chromosomes using these three probes were different from those of wheat chromosomes， and no oligonucleotide sequence elimination occurred during chromosome transformation. Therefore， FISH with these three probes could be used to identify H. chilense chromosomes in wheat background and be assistant to wheat breeding by chromosome engineering using the agronomical useful genes of H. chilense.

Key words Hordeum chilense； Addition line； Chromosome；FISH； Cytogenetic marker

智利大麥（Hordeum chilense），2n=2x=14，基因組HchHch，是一個主要分布于智利和阿根廷的二倍體物種。西班牙、新西蘭和英國科學(xué)家們對該物種的抗病性進(jìn)行了綜述，認(rèn)為該物種高抗葉銹病、白粉病、全蝕病、穎枯病、腥黑穗病、麥二叉蚜、麥雙尾蚜和禾谷孢囊線蟲；此外，該物種對鹽脅迫和干旱脅迫也具有一定的抗性，是小麥抗病抗逆育種的三級基因源。

智利大麥不僅易與大麥屬物種雜交，與小麥屬的山羊草、簇毛麥、偃麥草、黑麥和小麥等物種也很容易雜交成功。英國John Innes Centre的Miller教授課題組將智利大麥與小麥進(jìn)行雜交后對其進(jìn)行染色體加倍獲得了可育的小麥-智利大麥雙二倍體，進(jìn)而，以該雙二倍體為橋梁，將其與小麥進(jìn)行雜交回交，獲得了小麥-智利大麥染色體附加系與代換系，為定位相應(yīng)優(yōu)異農(nóng)藝性狀基因提供了材料。以這些材料為基礎(chǔ)，研究者分別將小麥葉枯病抗性基因定位在4Hch染色體上，將腥黑穗病抗病基因和控制類胡蘿卜素高含量的基因定位在7Hch染色體上，將抗鹽基因定位在1Hch、4Hch和5Hch染色體上，將禾谷孢囊線蟲抗性基因定位在1Hch染色體上，將細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的育性恢復(fù)基因定位在6Hch染色體上。endprint

分子標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記從不同研究層面對智利大麥染色體上的優(yōu)異基因向小麥轉(zhuǎn)育提供有力指導(dǎo)。智利大麥1Hch～7Hch染色體分子標(biāo)記已經(jīng)建立起來，部分細(xì)胞學(xué)結(jié)果也已經(jīng)發(fā)表。越多的分子和細(xì)胞標(biāo)記被建立起來，就越容易對該物種進(jìn)行染色體工程誘導(dǎo)改造并將其優(yōu)異基因用于小麥育種進(jìn)行后續(xù)指導(dǎo)。研究證明，利用多聚核苷酸Oligo-pTa535.1和Oligo-pSc119.2為探針可以對小麥42條染色體進(jìn)行有效區(qū)分，（GAA）8可以對大部分小麥染色體進(jìn)行鑒別，然而，是否可以利用前兩個探針或結(jié)合（GAA）8同時鑒定小麥背景中的小麥和智利大麥染色體尚不可知。鑒于此，我們開展了如下試驗。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用植物材料列于表1，由英國約翰英納斯中心（John Innes Centre，JIC）的Reader 教授和美國堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與基因資源中心（Wheat Genetic and Genomic Resources Center，WGGRC）的Gill 教授提供。

1.2染色體制片及FISH分析方法

試驗材料的根尖處理和染色體制片方法參見文獻(xiàn)[16]；以（GAA）8為探針進(jìn)行的原位雜交所用探針標(biāo)記方法、探針濃度、染色體制片洗脫步驟等參見文獻(xiàn)[15]；以O(shè)ligo-pTa535.1和 Oligo-pSc119.2為探針進(jìn)行的原位雜交所用探針合成、探針濃度及具體操作步驟等參見文獻(xiàn)[14]。原位雜交染色體制片自然干燥后，滴加0.25 μg/mL碘化丙啶并蓋上蓋玻片，在Olympus BX51熒光顯微鏡下進(jìn)行照相。

2結(jié)果與分析

2.1中國春-智利大麥雙二倍體的熒光原位雜交（FISH）分析

以O(shè)ligo-pTa535.1和 Oligo-pSc119.2為探針對中國春-智利大麥雙二倍體進(jìn)行FISH分析，發(fā)現(xiàn)該探針組合可以有效辨識42條小麥染色體（圖1A），與文獻(xiàn)[14]的報道吻合。而剩余14條智利大麥染色體雖有不同雜交信號，但是無法辨別其所屬同源群。Martin和Cabrera發(fā)現(xiàn)探針（GAA）8可以用于辨別智利大麥染色體同源群，因此，本研究對上述兩探針雜交過的染色體制片進(jìn)行信號洗脫后，用（GAA）8對其進(jìn)行二次雜交，結(jié)果顯示，剩余14條染色體雜交信號（圖1B）和文獻(xiàn)[4]報道相同，可以對其進(jìn)行染色體同源群認(rèn)定。

染色體制片質(zhì)量（主要指染色體是否被染色質(zhì)覆蓋）、探針量的多少及洗脫程度不同可能造成信號強(qiáng)度有所差異，因此，為了更好地描述Oligo-pTa535.1和 Oligo-pSc119.2在智利大麥染

注：A為探針Oligo-pTa535.1（紅色）和 Oligo-pSc119.2（綠色）的原位雜交結(jié)果；B為（GAA）8（紅色）的原位雜交結(jié)果。

圖1多聚核苷酸探針對中國春-智利大麥雙二倍體（2n=56）的原位雜交分析

色體上的雜交情況，提取處理FISH過的智利大麥10個完整細(xì)胞，其中3個細(xì)胞中的智利大麥染色體FISH情況如圖2所示。可見，5Hch和6Hch具有較大隨體。Oligo-pSc119.2在1Hch、5Hch和7Hch染色體短臂末端具有雜交信號，其中，1Hch雜交信號較強(qiáng)，而7Hch信號較弱；在2Hch和6Hch染色體長臂末端具有雜交信號；在4Hch染色體長臂和短臂末端均具有強(qiáng)雜交信號；而在3Hch染色體上沒有雜交信號；3個細(xì)胞間，僅7Hch雜交信號差異較明顯，可能是由于信號在該染色體上較弱而被Oligo-pTa535.1的強(qiáng)烈紅色信號覆蓋的緣故。

Oligo-pTa535.1在1Hch～7Hch上均具有強(qiáng)烈的雜交信號，且雜交信號幾乎布滿整條染色體，但各染色體雜交模式各不相同。僅1Hch的雜交信號在3個細(xì)胞間有所差異，即第1和第2個細(xì)胞在染色體長臂末端及亞端部有強(qiáng)雜交信號，而在染色體短臂的末端有非常弱或未見雜交信號；第3個細(xì)胞在短臂末端也有雜交信號，且在長臂末端至著絲粒區(qū)域具有強(qiáng)雜交信號。

（GAA）8在智利大麥各染色體上的信號位置及強(qiáng)度各不相同，3個細(xì)胞中相同的同源群染色體雜交信號幾乎完全相同，僅1Hch短臂末端弱信號有所差異（圖2）。染色體1Hch長臂末端具有較強(qiáng)的雜交信號，而短臂末端有非常弱的信號或未見雜交信號；2Hch長臂和短臂的亞端部都具有雜交信號，長臂信號相對較強(qiáng)；3Hch的信號主要分布在著絲粒處、短臂亞端部和長臂近端部，并且長臂近端部信號較弱； 4Hch著絲粒區(qū)域的信號非常強(qiáng)，而短臂近端部信號相對較弱； 5Hch的信號分布在短臂末端和近末端（隨體不包含在內(nèi)）；6Hch的雜交信號分布在長臂的亞端部；7Hch的信號分布在其著絲粒處、長臂和短臂近著絲粒處、短臂末端和近末端。

注：1～7行分別為智利大麥1Hch～7Hch染色體；第1～3、4～6和7～9列分別來自3個不同細(xì)胞；第1、4、7列為探針Oligo-pTa535.1（紅色）和 Oligo-pSc119.2（綠色）的原位雜交結(jié)果；第2、5、8列為探針（GAA）8（紅色）的原位雜交結(jié)果；第3、6、9列為對照，是原位雜交前的智利大麥染色體。

圖2多聚核苷酸探針在智利大麥

染色體上的雜交情況

2.2中國春-智利大麥附加系的FISH分析

研究表明，在植物多倍體化或染色體轉(zhuǎn)移過程中往往會出現(xiàn)序列的刪除或插入現(xiàn)象。因此，本研究除對中國春-智利大麥雙二倍體進(jìn)行FISH分析外，還對中國春-智利大麥1Hch和1HchS雜合附加系及4Hch、5Hch、6Hch、7Hch附加系進(jìn)行了FISH分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從雙二倍體到附加系轉(zhuǎn)移過程中，Oligo-pTa535.1和 Oligo-pSc119.2的雜交信號并未發(fā)現(xiàn)明顯改變或丟失。中國春-智利大麥1Hch和1HchS雜合附加系的FISH圖如圖3所示。endprint

注：A為探針Oligo-pTa535.1（紅色）和 Oligo-pSc119.2（綠色）的原位雜交結(jié)果；B為未原位雜交的染色體中期圖。

圖3多聚核苷酸探針對1Hch+1HchS附加系（2n=43+t，其中t=端體）的原位雜交分析

3結(jié)論與討論

智利大麥的染色體C分帶標(biāo)準(zhǔn)圖已經(jīng)發(fā)表，但尚沒有其染色體C帶序列組成的相關(guān)信息。Prieto等利用HvT01和（GAA）n對智利大麥染色體進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)前者僅在染色體末端有雜交信號，而后者在大多數(shù)染色體著絲粒和少數(shù)染色體末端有雜交信號，與智利大麥標(biāo)準(zhǔn)C帶位置明顯不同，因此，這兩類序列不可能是其染色體C帶的組成部分。Cabrera等利用探針pAs1和18S-26S核糖體RNA對智利大麥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)前者在所有Hch上具有雜交信號，然而，僅1Hch、6Hch和7Hch的雜交信號位置和染色體C分帶信號位置部分類似，而2Hch～5Hch信號與C分帶信號位置有所差異，因此，不是智利大麥染色體C分帶的組成部分；后者的雜交信號僅分布在5Hch和6Hch染色體上，與智利大麥標(biāo)準(zhǔn)C帶位置明顯不同，因此，18S-26S核糖體RNA也不可能是其染色體C分帶的組成部分。因而，我們對智利大麥染色體C帶序列組成還知之甚少。但本研究發(fā)現(xiàn)探針Oligo-pTa535.1在智利大麥上的雜交信號位置與其染色體C分帶位置幾乎全部吻合，推測其是其染色體C分帶的重要組成部分，該發(fā)現(xiàn)增加了對該物種染色體C帶序列的認(rèn)識。

智利大麥高抗小麥多種病害和脅迫，迄今為止，僅將少數(shù)幾個抗病基因定位在其染色體上，未被定位的抗病基因仍需要進(jìn)一步深入研究。因為大麥品質(zhì)相對小麥差，因此，其基因組內(nèi)優(yōu)異基因在小麥育種上并未得到有效利用，然而，可以利用染色體工程將相應(yīng)種質(zhì)誘導(dǎo)成小片段抗病易位系進(jìn)而應(yīng)用于小麥抗病育種工作。本研究發(fā)現(xiàn)Oligo-pTa535.1和Oligo-pSc119.2、（GAA）8在智利大麥各染色體上具有不同的雜交信號，能夠有效辨識智利大麥各條染色體，提供了一種檢測小麥背景中智利大麥染色體的新方法，可以為后續(xù)追蹤和檢測小麥中的智利大麥染色體提供細(xì)胞學(xué)指導(dǎo)。

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