高南等

摘要：Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及其他生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。AKT2/3是Shaker類型K+通道中唯一既主導(dǎo)K+內(nèi)流，又允許去極化情況下K+滲漏性外流的通道。水稻OsAKT2/3蛋白的生物信息學(xué)分析表明，OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標(biāo)志性序列TxxTxGYGD；該基因分子式為C4219H6693N1179O1233S35，理論等電點(diǎn)為664，氨基酸殘基組成中亮氨酸殘基含量最高；有一定的親水性，為跨膜蛋白；可能存在31個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)、5種結(jié)構(gòu)域、52個(gè)磷酸化位點(diǎn)，不含信號(hào)肽；序列主要構(gòu)件為α-螺旋和折疊延伸；該蛋白與其他植物的AKT2/3家族成員具有較高的同源性。試驗(yàn)結(jié)果為OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水稻；二級(jí)結(jié)構(gòu)；磷酸化位點(diǎn)；三級(jí)結(jié)構(gòu)；系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號(hào)：Q785；Q945.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0025-03

鉀是植物必需的大量元素，對(duì)提高作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)起著重要作用。水稻（Oryza sativa L.）對(duì)鉀素的需求量較大，不同基因型的水稻對(duì)土壤中鉀素的吸收利用存在很大差異[1]。缺鉀可影響細(xì)胞滲透壓平衡，進(jìn)而引起器官機(jī)能的破壞，影響植物的正常生長(zhǎng)；并通過(guò)植物激素調(diào)節(jié)破壞植物體內(nèi)的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，導(dǎo)致作物的產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降[2]。我國(guó)大部分耕地土壤供鉀不足，其中嚴(yán)重缺鉀土壤（速效鉀<50 mg/kg）約2 000萬(wàn)hm2，占耕地面積的20%以上，且主要分布于我國(guó)的水稻產(chǎn)區(qū)；因此，需施用鉀素化肥以保證水稻的豐產(chǎn)和品質(zhì)，而我國(guó)鉀礦資源十分匱乏，95%以上的鉀肥供應(yīng)依賴進(jìn)口[3]。K+通道在植物體內(nèi)的表達(dá)能改良植物的鉀素營(yíng)養(yǎng)性狀[4-5]；因此，挖掘植物中鉀吸收利用的基因并研究其生理功能，對(duì)水稻鉀營(yíng)養(yǎng)性狀的改良及現(xiàn)有鉀素資源的利用具有重要意義。Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及其他生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2，6-7]。AKT2/3是Shaker類型K+通道中唯一既主導(dǎo)K+內(nèi)流、又允許去極化情況下K+滲漏性外流的通道，其電生理特征表現(xiàn)為弱內(nèi)向整流、能夠感應(yīng)K+水平、受Ca2+和H+調(diào)控[8-9]。其獨(dú)有的滲漏型電流，在過(guò)量K+迅速吸收進(jìn)入細(xì)胞而導(dǎo)致的膜電位去極化情況下，通過(guò)胞內(nèi)K+的滲漏從而實(shí)現(xiàn)對(duì)膜電位的精確微調(diào)作用[10]。目前，水稻的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，但關(guān)于水稻K+通道的研究尚較少[11-13]。本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)水稻OsAKT2/3蛋白的理化性質(zhì)、核苷酸序列組成、跨膜結(jié)構(gòu)、親水性、疏水性、亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，并對(duì)其結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，最后進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以全面了解OsAKT2/3基因，為該基因生理功能的深入研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已注冊(cè)水稻OsAKT2/3基因（JN989970.1）、擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]的AKT2/3（NP_567651.1）、大麥（Hordeum vulgare L.）的HvAKT2（ABE99811.1）、雨樹(shù)[Samanea saman （Jacq.）Merr.]的SPICK1（AAD16278.1）和SPICK2（AAD39492.1）、歐美楊（Populus tremula L.×Populus tremuloides Michx.）的PTK2（CAC05489.1）、玉米（Zea mays L.）的ZMK2（NP_001105120.1）。1.2方法

OsAKT2/3蛋白的理化性質(zhì)使用ProtParam軟件在線分析；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)使用TMHMM軟件在線分析；親水性及疏水性使用ProtScale軟件在線分析；蛋白亞細(xì)胞定位使用TargetP軟件、WoLF PSORT軟件在線分析；蛋白序列上潛在的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)使用MotifScan軟件、CCD軟件預(yù)測(cè)；蛋白磷酸化位點(diǎn)使用NetPhos軟件在線分析；蛋白信號(hào)序列使用SignalP4.1軟件在線分析；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)使用SOPMA軟件在線分析；蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)使用Phyre2軟件在線分析；利用MEGA 6.05軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。上述各分析軟件的網(wǎng)址見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1OsAKT2/3蛋白的理化性質(zhì)分析

由序列分析結(jié)果可知，OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標(biāo)志性序列TxxTxGYGD。用ProtParam軟件分析得知，OsAKT2/3 蛋白共有13 359個(gè)原子，分子量為94 783.8，蛋白的分子式為C4219H6693N1179O1233S35，理論等電點(diǎn)為6.64。在855個(gè)氨基酸殘基組成中，OsAKT2/3蛋白的N端為蛋氨酸，含量較高的氨基酸殘基包括亮氨酸殘基（10.2%）、纈氨酸殘基（8.5%）、甘氨酸殘基（7.3%）、精氨酸殘基（7.1%）、絲氨酸殘基（7.1%）；含量較低的氨基酸殘基包括色氨酸殘基（1.1%）、半胱氨酸殘基（1.4%）等。帶負(fù)電荷的氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）殘基為99個(gè)；帶正電荷的氨基酸（精氨酸、賴氨酸）殘基為95個(gè)。OsAKT2/3蛋白在哺乳動(dòng)物、酵母、大腸桿菌中的半衰期分別為30 h（體外）、>20 h（體內(nèi)）、>10 h（體內(nèi)），不穩(wěn)定指數(shù)為39.03，該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

2.2OsAKT2/3蛋白的親水性、疏水性、亞細(xì)胞定位

使用ProtScale軟件預(yù)測(cè)OsAKT2/3蛋白的親水性及疏水性可知，氨基酸的最低分值為-2.967，最高分值為3.133（圖1）。整體來(lái)看，親水性氨基酸殘基分布于整條肽鏈，且多于疏水性氨基酸殘基。使用TMHMM軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，將參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，可知OsAKT2/3蛋白為跨膜蛋白。WolfPsort軟件預(yù)測(cè)該蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)膜上，TargetP軟件預(yù)測(cè)該蛋白在葉綠體膜上的可能性為79.6%。

2.3OsAKT2/3蛋白結(jié)構(gòu)域、功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

OsAKT2/3蛋白序列上潛在的結(jié)構(gòu)域、功能位點(diǎn)使用MotifScan軟件、CCD軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該蛋白可能存在的翻譯后修飾位點(diǎn)包括1個(gè)酰胺化位點(diǎn)、4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)cAMP磷酸化位點(diǎn)、11個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ位點(diǎn)、7個(gè)酰化位點(diǎn)、7個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)5種結(jié)構(gòu)域，分別為錨蛋白重復(fù)（ANK，cd00204）、環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CAP_ED，cd00038）、未知功能的DUF3354超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域（DUF3354，pfam11834）、離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域（Ion_trans_2，pfam07885）、電壓依賴的鉀離子通道結(jié)構(gòu)域（PLN03192，PLN03192）（圖2）。該蛋白具有Shaker基因家族的典型特征，即蛋白的N末端包括6個(gè)跨膜區(qū)（S1～S6），有電壓感受區(qū)和高度保守的通道孔區(qū)。使用磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)程序NetPhos 2.0發(fā)現(xiàn)OsAKT2/3蛋白有37個(gè)潛在的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)潛在的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。使用SignalP 4.1 Server軟件在線分析OsAKT2/3蛋白的信號(hào)肽情況，結(jié)果顯示該蛋白不含信號(hào)肽序列。

2.4OsAKT2/3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)OsAKT2/3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示OsAKT2/3蛋白由43.16%的α-螺旋、17.19%的折疊延伸、8.30%的β-轉(zhuǎn)角、31.35%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中折疊延伸和β-轉(zhuǎn)角不均勻分布于整個(gè)蛋白質(zhì)的多肽鏈上。依據(jù)模板c2ptmA，采用折疊識(shí)別法，使用Phyer2軟件在線預(yù)測(cè)OsAKT2/3蛋白序列主鏈原子位置，生成預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖3），并依據(jù)能量最小化原理使側(cè)鏈集團(tuán)處于能量最小的位置。該蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相似。

2.5OsAKT2/3編碼基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI上共選取6種植物的7個(gè)AKT2/3基因序列，以擬南芥KAT1基因作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，水稻OsAKT2/3在進(jìn)化上與單子葉植物玉米的ZMK2、單子葉植物大麥的HvAKT2的親緣關(guān)系較近，與雙子葉植物擬南芥的AKT2/3等有較高的相似度（圖4）。

3結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)的功能不僅取決于其一級(jí)結(jié)構(gòu)，在很大程度上也取決于其高級(jí)結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、生物學(xué)的各種工具，較好地闡明和理解大量數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義?；蛐蛄屑捌涮匦苑治觥⒌鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬等是生物信息學(xué)的重要組成部分。利用生物信息學(xué)的原理，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬相關(guān)的輔助信息，可在較短時(shí)間內(nèi)，用較低成本獲得大量可靠的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能信息[14-15]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)資源，在前期獲得水稻OsAKT2/3的基礎(chǔ)上，應(yīng) 用ProtParam、TMHMM等分析軟件，對(duì)OsAKT2/3蛋白的亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等蛋白特性進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析模擬，以期盡可能多地獲得該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的信息，為OsAKT2/3基因功能的研究提供更多、更可靠的理論依據(jù)。

Shaker類型K+通道在植物鉀的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及其他生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2，6，11]。OsAKT2/3蛋白含有K+通道的標(biāo)志性序列TxxTxGYGD；該基因分子式為C4219H6693N1179O1233S35，理論等電點(diǎn)為6.64，氨基酸殘基組成中亮氨酸殘基含量最高；有一定的親水性，為跨膜蛋白；可能存在31個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)、5種結(jié)構(gòu)域、52個(gè)磷酸化位點(diǎn)，不含信號(hào)肽；序列主要構(gòu)件為α-螺旋和折疊延伸；該蛋白與其他植物的AKT2/3家族成員具有較高的同源性。本試驗(yàn)結(jié)果為OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依據(jù)。然而，同源性僅是基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)上的類似，雖然某些典型功能相近，但來(lái)源不同的同源通道常表現(xiàn)出獨(dú)特之處。在氨基酸序列、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件上，玉米的ZmK2.1 K+通道與擬南芥的KAT1通道均高度同源，但其功能特征卻存在顯著差異[16]。與其他AKT2/3型K+通道相比，OsAKT2/3的功能特征是否存在獨(dú)特之處仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王為木，楊肖娥，魏幼璋，等. 水稻不同基因型吸收利用土壤鉀素的差異[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2005，31（1）：52-58.

[2]Wang Y，Wu W H. Potassium transport and signaling in higher plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2013，64：451-476.

[3]李慶逵，朱兆良，于天仁. 中國(guó)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展中的肥料問(wèn)題[M]. 南昌：江西科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

[4]施衛(wèi)明，王校常，嚴(yán)蔚東，等. 外源鉀通道基因在水稻中的表達(dá)及其鉀吸收特征研究[J]. 作物學(xué)報(bào)，2002，28（3）：374-378.

[5]Lebaudy A，Vavasseur A，Hosy E，et al. Plant adaptation to fluctuating environment and biomass production are strongly dependenton guard cell potassium channels[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（13）：5271-5276.

[6]Véry A A，Sentenac H. Molecular mechanisms and regulation of K+transport in higher plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2003，54：575-603.

[7]馬小娟，戚金亮，印莉萍，等. 植物鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白及基因研究進(jìn)展[J]. 首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，25（2）：41-45.

[8]Marten I，Hoth S，Deeken R，et al. AKT3，a phloem-localized K+channel，is blocked by protons[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，96（13）：7581-7586.

[9]Lacombe B，Pilot G，Michard E，et al. A shaker-like K+ channel with weak rectification is expressed in both source and sink phloemtissues of Arabidopsis[J]. The Plant Cell，2000，12（6）：837-851.

[10]Gajdanowicz P，Michard E，Sandmann M，et al. Potassium （K+） gradients serve as a mobile energy source in plant vascular tissues[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（2）：864-869.

[11]Fuchs I，Stlzle S，Ivashikina N，et al. Rice K+uptake channel OsAKT1 is sensitive to salt stress[J]. Planta，2005，221（2）：212-221.

[12]Gupta M，Qiu X，Wang L，et al. Kt/HAK/KUP potassium transporters gene family and their whole-life cycle expression profile in rice（Oryza sativa）[J]. Molecular Genetics and Genomics，2008，280（5）：437-452.

[13]Obata T，Kitamoto H K，Nakamura A，et al. Rice shaker potassium channel OsKAT1 confers tolerance to salinity stress on yeast and rice cells[J]. Plant Physiology，2007，144（4）：1978-1985.

[14]Elmasri R，Ji F，F(xiàn)u J，et al. Modelling concepts and database implementation techniques for complex biological data [J]. International Journal of Bioinformatics Research and Applications，2007，3（3）：366-388.

[15]Kelley L A，Sternberg M J. Protein structure prediction on the web：a case study using the Phyre server[J]. Nature Protocols，2009，4（3）：363-371.

[16]Su Y H，North H，Grignon C，et al. Regulation by external K+in a maize inward shaker channel targets transport activity in the high concentration range [J]. The Plant Cell，2005，17（5）：1532-1548.