龔秋菊

摘 要：植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育是廣泛存在于高等植物中的一種生物現(xiàn)象，利用CMS系及其恢復(fù)系，在育種上存在巨大的應(yīng)用價(jià)值。不同的分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到植物的CMS研究中，從而發(fā)掘與CMS密切相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)基因。同時(shí)，利用分子標(biāo)記輔助育種開(kāi)發(fā)與恢復(fù)基因連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)提高育種效率有重要意義。本文就分子標(biāo)記技術(shù)在植物的CMS研究進(jìn)展進(jìn)行概括論述。

關(guān)鍵詞：CMS；分子標(biāo)記；線粒體；恢復(fù)基因

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.10.003

Abstract： Cytoplasmic male sterility is one of the biological phenomenon widespread in higher plants. Using CMS lines and its restorer lines has a huge application value in breeding. In order to excavate the cytoplasm genes that closely associated with CMS， different molecular marker technology has been widely applied to CMS studies. At the same time， using molecular-marker assisted selecting technology to exploit the molecular markers which interlock with the restoring genes， has an important significance to improve the efficiency of breeding. This paper summarized a review focusing on the progress on molecular marker technology in plant CMS.

Key words：CMS； molecular markers； mitochondrion； restorer gene

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（cytoplasmic male sterility，CMS）最早是由Jones等于1936年首次在洋蔥中發(fā)現(xiàn)的一種生物現(xiàn)象，廣泛存在于高等植物中，其遺傳方式屬于母系遺傳[1]。植物CMS是指雌蕊發(fā)育正常、雄蕊發(fā)育不正常且不能產(chǎn)生正常功能花粉的現(xiàn)象。已有的研究結(jié)果主要集中在兩個(gè)方面：一是細(xì)胞質(zhì)線粒體和葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄、翻譯方面的差異與CMS的關(guān)系；二是恢復(fù)基因的調(diào)控。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物CMS的研究，并發(fā)掘出與CMS密切相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)基因片段[2-5]。

1 線粒體與CMS的關(guān)系

根據(jù)前人的研究結(jié)果來(lái)看，研究者普遍認(rèn)為導(dǎo)致植物CMS的主要因素與細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)，尤其是線粒體基因組有關(guān)。目前對(duì)細(xì)胞質(zhì)不育形成機(jī)理公認(rèn)的觀點(diǎn)主要有兩種：一種是細(xì)胞質(zhì)中線粒體與葉綠體基因組發(fā)生基因突變、重排，導(dǎo)致基因編碼的蛋白質(zhì)喪失功能從而引起不育；另一種是線粒體基因重排的產(chǎn)物會(huì)阻礙花粉的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致CMS。目前對(duì)線粒體基因與植物CMS關(guān)系的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：（1）線粒體基因發(fā)生插入、缺失等基因突變；（2）線粒體基因組發(fā)生重排產(chǎn)生新的開(kāi)放閱讀框；（3）線粒體RNA編輯異常；（4）線粒體能量代謝相關(guān)基因異常。

高等植物線粒體基因組不僅數(shù)量大（200～2 500 kb之間），而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要以線型、開(kāi)環(huán)、閉環(huán)、超螺旋等形式存在。并且線粒體基因組含有大量的正向重復(fù)序列、反向重復(fù)序列、非編碼序列和一部分未知來(lái)源的序列。線粒體基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多樣性導(dǎo)致線粒體基因組極易發(fā)生重排、插入、缺失等突變。由于線粒體是細(xì)胞供能的主要場(chǎng)所，并且參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信息傳遞等過(guò)程，這些過(guò)程任何一步發(fā)生異常都會(huì)導(dǎo)致線粒體功能異常，從而導(dǎo)致CMS的發(fā)生。目前，在水稻[6]、玉米[7-8]、棉花[9]、矮牽牛[10]、小麥[11]等多種植物的CMS研究中，已確定多個(gè)與CMS密切相關(guān)的胞質(zhì)基因。

2 常用的分子標(biāo)記技術(shù)

2.1 分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)介

分子標(biāo)記（molecular marker）技術(shù)是指能夠直接反映生物個(gè)體或種群間遺傳物質(zhì)差異性的特異DNA片段，是直接以核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，已有十余種分子標(biāo)記技術(shù)被用于基因克隆與定位、基因庫(kù)構(gòu)建、物種親緣關(guān)系鑒定、分子標(biāo)記輔助育種及遺傳多態(tài)性分析等方面的研究。

分子標(biāo)記具有很多特點(diǎn)，如：（1）遺傳多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性強(qiáng)；（2）可以在不破壞遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)，不影響基因表達(dá)的情況下揭示DNA的變異；（3）操作簡(jiǎn)便快捷；（4）便于隱性性狀的選擇；（5）可檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段及不同組織，分布均勻。根據(jù)分子標(biāo)記的特點(diǎn)，通常將其分為以下幾類：（1）以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，主要有RFLP；（2）以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，其中以隨機(jī)引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)有RAPD標(biāo)記，以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)有SSR、ISSR、SRAP、SCAR等標(biāo)記；（3）基于PCR與限制性酶切相結(jié)合的分子標(biāo)記，其中通過(guò)對(duì)限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增來(lái)表現(xiàn)多態(tài)性的分子標(biāo)記，代表有AFLP標(biāo)記。通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增片段的限制性酶切來(lái)表現(xiàn)多態(tài)性的分子標(biāo)記，代表有CAPS標(biāo)記[12]。

2.2 常用的分子標(biāo)記技術(shù)種類

2.2.1 限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP） 限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）最早是由Grodzicker于1974年提出的，此技術(shù)是以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。其基本原理是：用特定的限制性內(nèi)切酶對(duì)生物基因組DNA進(jìn)行酶切，獲得大小不同的酶切片段，通過(guò)凝膠電泳分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用目的基因探針與酶切片段進(jìn)行Southern雜交，通過(guò)顯影技術(shù)得到特異片段的RFLP圖譜。由于基因突變、重組等導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的改變或酶切片段大小的改變均能形成RFLP多態(tài)性圖譜[13-14]。其優(yōu)缺點(diǎn)如下。RFLP標(biāo)記技術(shù)作為一種常用的分子標(biāo)記方法，具有很多優(yōu)點(diǎn)，如：（1）不受環(huán)境條件、組織特異性及顯隱性因素的影響；（2）標(biāo)記位點(diǎn)在數(shù)量上沒(méi)有限制；（3）結(jié)果豐度高，穩(wěn)定性好，結(jié)果可靠。缺點(diǎn)：（1）所需要的DNA含量較多純度較高；（2）操作繁瑣，周期長(zhǎng)，成本較高；（3）同位素探針也可能對(duì)人和環(huán)境造成損傷等[15]。

2.2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD） 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphisms DNA，RAPD）是由Wiliam和Welsh等人于1990年在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是：利用長(zhǎng)為8～10 bp的隨機(jī)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，針對(duì)特定的基因型，由于每個(gè)引物都有與其特異結(jié)合的DNA位點(diǎn)，如果發(fā)生堿基插入、缺失、替換等突變，會(huì)導(dǎo)致特異結(jié)合位點(diǎn)的改變，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，就會(huì)得到DNA片段長(zhǎng)度或數(shù)量的改變，從而檢測(cè)DNA片段的多態(tài)性[16-18]。RAPD標(biāo)記技術(shù)與RFLP相比有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）對(duì)DNA含量要求不高；（2）操作簡(jiǎn)便、快捷，成本低；（3）能反映出整個(gè)基因組的多態(tài)性，具有較高的豐度；（4）引物可以適用于不同生物個(gè)體不同基因組結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。缺點(diǎn)：（1）穩(wěn)定性不高，重復(fù)性較差；（2）不能鑒別純合與雜合基因；（3）有很大的變異性，近親關(guān)系的物種間也可能產(chǎn)生極大差異[19-20]。

2.2.3 特征序列擴(kuò)增區(qū)域（SCAR） 序列特征性擴(kuò)增區(qū)域（sequence-characterized amplified region，SCAR）是首先由Parar和Michlmore提出的一種分子標(biāo)記技術(shù)，它是在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。其基本原理是：先對(duì)基因進(jìn)行RAPD分析，將目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，根據(jù)原RAPD片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物通常是在RAPD引物的5端與3端延長(zhǎng)14個(gè)堿基，長(zhǎng)度為24 bp。目的是為了鑒別與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)[21]。該技術(shù)與RAPD技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性好，重復(fù)性強(qiáng)；（2）顯性遺傳，直接根據(jù)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)；（3）操作簡(jiǎn)便快捷[22]。

2.2.4 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP） 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是由荷蘭科學(xué)家Vos等[23]創(chuàng)建的一種新型的分子標(biāo)記，它同時(shí)結(jié)合了RFLP與RAPD技術(shù)的特點(diǎn)。其基本原理是：用兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行充分酶切，產(chǎn)生大小不同的DNA限制性片段，將雙鏈人工接頭與酶切片段進(jìn)行連接，作為PCR擴(kuò)增模板。用含有人工接頭互補(bǔ)序列、限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列、3端選擇性堿基的引物對(duì)模板進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增，只有引物的選擇性堿基與限制性酶切位點(diǎn)側(cè)翼的3個(gè)核苷酸配對(duì)，才能擴(kuò)增出產(chǎn)物，通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)有無(wú)DNA指紋檢測(cè)多態(tài)性。其優(yōu)缺點(diǎn)：AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD兩種分子標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)，具有多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高，效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。但是該技術(shù)對(duì)DNA的純度與含量要求很高，不同材料需要不斷摸索最適的操作條件，并且酶的費(fèi)用較昂貴。盡管AFLP標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)生比較晚，但被普遍認(rèn)為是一種理想有效的分子標(biāo)記技術(shù)。已被廣泛應(yīng)用于水稻[24]、茶樹(shù)[25]、小麥[26]、辣椒[27]等多種作物的研究應(yīng)用上。

2.2.5 SSR分子標(biāo)記 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR） 標(biāo)記技術(shù)最早是在1989年由Litt等[28]建立的。SSR又稱微衛(wèi)星DNA，它是由1～6 bp的核苷酸為單位串聯(lián)重復(fù)組成的一段核苷酸序列，一般常見(jiàn)（CA）n和（TG）n串聯(lián)的雙核苷酸重復(fù)序列。SSR廣泛存在于基因組的各個(gè)座位上，其兩端的側(cè)翼序列多是保守的單拷貝序列，由于重復(fù)單位數(shù)量的不同會(huì)造成多態(tài)性發(fā)生。其基本原理是：根據(jù)SSR兩端保守序列設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星DNA片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出串聯(lián)重復(fù)數(shù)不同導(dǎo)致的PCR產(chǎn)物大小不同的多態(tài)性片段。其優(yōu)點(diǎn)有：（1）所需DNA量少；（2）呈共顯性遺傳，可鑒別純合基因和雜合基因；（3）可檢測(cè)到單一的多等位基因位點(diǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)。缺點(diǎn)：（1）SSR標(biāo)記數(shù)量有限，開(kāi)發(fā)引物難度大；（2）建立和篩選基因組文庫(kù)較費(fèi)時(shí)。

3 分子標(biāo)記技術(shù)在CMS中的應(yīng)用

雜種優(yōu)勢(shì)（heterosis）是生物界中普遍存在的一種現(xiàn)象，它是指兩個(gè)遺傳性狀不同的親本雜交，產(chǎn)生的雜種一代繼承了其父母本的不同優(yōu)勢(shì)，在生活力、繁殖力、抗逆性、質(zhì)量和產(chǎn)量等方面超過(guò)其雙親的現(xiàn)象[29]。利用CMS系及其恢復(fù)系，不僅可以省去人工去雄的繁瑣工作，而且為研究核質(zhì)遺傳互作交流提供有價(jià)值的研究模型。因此CMS是雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)外研究者廣泛將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于多種作物的CMS研究，從遺傳學(xué)、生理生化等方面深入到分子水平。早在1976年，Levings等[30]率先將RFLP標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于玉米的CMS研究中，并篩選得到與玉米CMS相關(guān)基因。隨后，在水稻研究中，1994年，許仁林等[31]利用AP-PCR方法對(duì)6個(gè)水稻品種線粒體進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在不育系及F1代中與不育相關(guān)的特異片段。凌古元等[32]運(yùn)用AFLP技術(shù)對(duì)野敗型水稻不育系、保持系及雜種F1代線粒體DNA進(jìn)行比較分析，找出與不育相關(guān)的三條差異條帶，分別是ZA1、ZA2、ZA3。2002年，利用RAPD技術(shù)篩選出與水稻CMS相關(guān)的長(zhǎng)為1 600 bp的特異片段[33]。在小麥中也均發(fā)現(xiàn)不育系與保持系mtDNA之間的差異，運(yùn)用RFLP技術(shù)對(duì)3種小麥不育系（T、K、V型）的mtDNA進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果三者的mtDNA在結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，并且與其共同的保持系相比也有顯著不同[34]。黃占景等[35]利用RAPD技術(shù)，發(fā)現(xiàn)T型小麥不育系與保持系之間表現(xiàn)出多態(tài)性，其中有10個(gè)單引物和一組雙引物。隨后利用RAPD技術(shù)對(duì)小麥不育系89AR、保持系原冬3號(hào)及保持系的mtDNA進(jìn)行比較研究，結(jié)果不育系與保持系間差異顯著，并推測(cè)這些差異與不育相關(guān)[36]。在棉花中，王學(xué)德[37]以哈克尼西棉CMS系及其保持系為材料，對(duì)其mtDNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE、RFLP、RAPD分析，結(jié)果RAPD分析發(fā)現(xiàn)不育系和保持系線粒體基因組間存在明顯差異，以4個(gè)mtDNA探針進(jìn)行RFLP分析，不育系mtDNA缺失一段1.9 kb的coxⅡ同源序列。蛋白質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)不育系中缺失一條分子量為31 kD的多肽，結(jié)果將這種coxⅡ基因的突變與蛋白質(zhì)的缺失聯(lián)系在了一起。

4 分子標(biāo)記在不育恢復(fù)基因方面的應(yīng)用

傳統(tǒng)的育種方法在選育恢復(fù)系材料時(shí)，主要依賴于植物的表型進(jìn)行選擇，需要通過(guò)連續(xù)多代回交并在開(kāi)花期才能鑒別植株育性，這樣不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且會(huì)受到環(huán)境條件影響。在長(zhǎng)期的育種實(shí)踐和分子生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)上，分子標(biāo)記輔助育種選擇技術(shù)（molecular-marker assisted selecting，MAS）已不斷運(yùn)用到鑒別不育恢復(fù)系材料中，其基本原理是借助與目的基因緊密連鎖的DNA標(biāo)記，達(dá)到選擇目標(biāo)性狀的目的，能快速準(zhǔn)確地對(duì)材料進(jìn)行選育，極大地縮短了育種周期，提高了育種效率。應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種的標(biāo)記方法主要有RAPD、RFLP、SSR、AFLP等。

高等植物CMS的產(chǎn)生是受到細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的共同作用結(jié)果，因此標(biāo)記CMS恢復(fù)系的核恢復(fù)基因（Rfs）在育種過(guò)程中也至關(guān)重要。在棉花中，Lan等[38]發(fā)現(xiàn)一個(gè)與育性恢復(fù)基因Rf1有連鎖關(guān)系的RAPD標(biāo)記UBC6592；Zhang等[39]利用AFLP標(biāo)記技術(shù)篩選得到兩個(gè)與Rf3緊密連鎖的標(biāo)記，CAPSE3P1和SCARE12M7。在油菜中，劉平武等[40]從可育池與不育池中利用RAPD、SSR、AFLP等標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行篩選，獲得與Rfp基因緊密連鎖的2個(gè)分子標(biāo)記。在水稻中，Tan等[41]篩選出2個(gè)與育性恢復(fù)基因緊密連鎖的RFLP標(biāo)記；景潤(rùn)春等[42]篩選出水稻野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因緊密連鎖的ISSR標(biāo)記UBC-835。在大豆中，王青山等[43]利用AFLP標(biāo)記技術(shù)從恢復(fù)系中得到一段長(zhǎng)310 bp的特異片段，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

5 展 望

綜上所述，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于植物CMS的研究中，并發(fā)揮重要作用。通過(guò)從分子水平對(duì)不育相關(guān)基因進(jìn)行探索，以及對(duì)恢復(fù)基因定位等方面研究均取得了很大進(jìn)展。但是這些研究遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代育種的需求，由于植物CMS及其育性恢復(fù)現(xiàn)象形成過(guò)程具有復(fù)雜多樣性，以及環(huán)境因素對(duì)其形成有很大影響，因此，植物CMS不育相關(guān)基因的機(jī)理還有待于進(jìn)一步探索。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種新技術(shù)也不斷被開(kāi)拓創(chuàng)新，分子標(biāo)記技術(shù)也日臻完善。從與CMS相關(guān)基因的分子標(biāo)記與定位等分子水平研究植物CMS分子機(jī)理，也會(huì)更準(zhǔn)確、有效地用于CMS相關(guān)基因的定向育種，從而加快育種的進(jìn)程。

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