張靜　任君等

摘 要：在水培條件下，研究不同濃度Cd2+脅迫對(duì)水芹幼苗葉綠素含量、葉綠體超微結(jié)構(gòu)、抗氧化系統(tǒng)等生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，高濃度Cd2+脅迫下，水芹幼苗葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)有明顯損傷，當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到2、5mg·L-1時(shí)超微結(jié)構(gòu)顯示，膜系統(tǒng)邊緣逐漸不清晰，葉綠體空泡體積增大，基質(zhì)片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少；當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到10mg·L-1時(shí)，基粒片層扭曲、變形、松散，基質(zhì)稀薄。與對(duì)照組相比，Cd2+濃度為2、5mg·L-1時(shí)，葉綠素總量和葉綠素a含量均顯著下降。隨著Cd2+濃度逐漸增高，水芹葉片中MDA、H2O2、[O-2·]含量均顯著上升，SOD與 Cd2+濃度呈現(xiàn)反比例關(guān)系，而POD、CAT活性在整個(gè)濃度梯度中均表現(xiàn)為先上升后下降。

關(guān)鍵詞：鎘；水芹幼苗；葉綠體超微結(jié)構(gòu)；抗氧化系統(tǒng)

中圖分類號(hào) Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）18-28-04

Effects of Cadmium on Physiological Indexes and Ultrastructure in Chloroplast in Cress Seedlings

Zhang Jing et al.

（Fisheries Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China ）

Abstract：The effects of different concentrations of Cd2+ on cress seedlings chlorophyll contents，ultrastrucure in chloroplast and antioxidative system were investigated using water culture method.The results indicated that chloroplast structure under high concentration of Cd2+ on cress seedlings have significant damage，membrane of chloroplast became foggy at 2 and 5mg·L-1 Cd2+，chloroplast vacuolated apparently，the slices of basal granule and thylakoids reduced，the slices of basal granule were distorted or even disintegrated，matrix was tenuous 10mg·L-1 Cd2+. Compared with the control，total chlorophyll and chlorophyll a levels significantly decreased at 10 mg·L-1 Cd2+. With increase in the concentration of Cd2+ the levels of MDA、H2O2、O2·- in cress seedlings significantly increased，SOD activity and concentration of Cd2+showed an inverse relationship，however POD and CAT activity increased and then decreased after.

Key words：Cadmium；Cress seedling；Ultrastructure in chloroplast；Antioxidative system

水芹（Oenanthe stolonifera D.C.）屬于傘形科、水芹菜屬多年水生宿根草本植物，是水生蔬菜的一種，在我國(guó)分布廣泛，常分布在河溝水田旁，具有耐寒、喜水、適宜短日照季節(jié)生長(zhǎng)的特性。自然生長(zhǎng)的水芹能夠在污水溝渠旁生長(zhǎng)并且長(zhǎng)勢(shì)旺盛，表明它有極強(qiáng)吸收N、P的能力，同時(shí)很多研究表明水芹對(duì)重金屬有一定的富集、吸附作用。申華[1]等人對(duì)水芹等3種水草對(duì)鎘污染水體的修復(fù)作用試驗(yàn)中得出，在Cd2+10mg/L的高濃度下處理14d后水芹中鎘的富集量達(dá)到92.98mg/kg，華大春[2]等人對(duì)土培水芹不同器官中的鎘富集特性作了研究，結(jié)果表明低濃度Cd2+對(duì)水芹的生物量有一定的促進(jìn)增長(zhǎng)作用?，F(xiàn)今相關(guān)研究多集中在水芹對(duì)重金屬鎘的富集吸收作用，而鎘對(duì)水芹的生理毒害特性鮮有報(bào)道。為此，本文通過(guò)研究在不同濃度外源Cd2+脅迫下水芹幼苗的相關(guān)生理特性，探究Cd2+濃度脅迫對(duì)水芹幼苗的毒害機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 水芹幼苗購(gòu)自安慶山泉水生蔬菜研究所，采用浮床無(wú)基質(zhì)栽培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將水芹苗進(jìn)行生根處理，數(shù)天后選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、株高和鮮重一致、多新鮮根的水芹苗留為試驗(yàn)用。培養(yǎng)瓶采用500mL黑色聚乙烯瓶，在瓶蓋上鉆孔，苗采用海綿固定，每瓶培養(yǎng)5株幼苗，并通氣。將水芹苗移入含有400mL不同Cd2+濃度的Hoaglands營(yíng)養(yǎng)液[3]中培養(yǎng)。采用5個(gè)鎘濃度梯度0.2、1、2、5、10mg·L-15個(gè)Cd2+水平和一個(gè)空白對(duì)照組，Cd2+由CdCl2提供，每個(gè)處理3個(gè)平行。每天10h的光照（15W日光燈），光照時(shí)培養(yǎng)溫度為25℃。10d后檢測(cè)Cd2+對(duì)水芹生長(zhǎng)狀態(tài)和生理特征影響。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 透射電鏡樣品的制備和電鏡觀察（1）取材固定：用手術(shù)刀片快速切取水芹葉片1mm2左右大小，用生理鹽水清洗組織，固定于4℃的2.5%戊二醛中6h，后取出后放到1.5mL離心管內(nèi)離心10min（2 000r/min）；（2）漂洗：用磷酸緩沖液（0.1mol·L-1，pH7.2）沖洗4次，每次間隔45min；（3）后固定：將組織后固定于1%鋨酸1h；（4）塊染：70%醋酸鈾乙醇飽和液中浸泡10h；（5）脫水：在30%、50%、80%、95%乙醇中依次脫水各15min，無(wú)水乙醇中脫水2次各40min；（6）滲透：環(huán)氧丙烷代換1次30min，環(huán)氧炳烷：環(huán)氧樹脂1∶1滲透2h，環(huán)氧炳烷∶環(huán)氧樹脂1∶2滲透1h，浸環(huán)氧樹脂（Epon812）2h；（7）包埋聚合：環(huán)氧樹脂包埋，后入45℃烤箱中12h，65℃烤箱中48h；（8）切片：取出包埋好的組織進(jìn)行超薄切片，片厚70nm；（9）染色：將切好的片子水洗后放入醋酸鈾飽和水溶液中30min，雙蒸水洗×3次15min，入枸櫞酸鉛染液15min，雙蒸水洗×3次10min；（10）電鏡觀察和拍照：用日產(chǎn)JEM-1230型透射觀察并拍照[4]。

1.3.2 植物生化指標(biāo)測(cè)定 鮮葉葉綠素含量的用二甲亞砜法[5]測(cè)定。MDA含量的測(cè)定：硫代巴比妥酸法（TBA）[6]；SOD、POD、CAT活性的測(cè)定：植物ELISA檢測(cè)試劑盒（北京天根生物有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)分析 所有測(cè)定數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），并用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，經(jīng)分析有效的數(shù)據(jù)（P<0.05）進(jìn)行多重分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+對(duì)水芹幼苗葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響 研究結(jié)果表明，高濃度Cd2+對(duì)水芹幼苗葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)有明顯損傷，主要表現(xiàn)為葉綠體膨脹成圓球形，葉綠體空泡增多，基質(zhì)片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少、排列不規(guī)則等現(xiàn)象。同時(shí)Cd2+的積累對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞核有明顯的破壞，使細(xì)胞膜變薄，通透性增加，細(xì)胞核壓縮，密度增大。主要表現(xiàn)為：在低濃度下·Cd2+（0.2、1mg·L-1）與對(duì)照相比，水芹幼苗葉片的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化，葉綠體外形呈長(zhǎng)橢圓形，基質(zhì)片層排列規(guī)則、清晰，基粒類囊體分布均勻；當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到2、5mg·L-1時(shí)，膜系統(tǒng)邊緣逐漸不清晰，葉綠體空泡體積加大，基質(zhì)片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少；當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到10mg·L-1時(shí)，葉綠體膨大呈球形，基質(zhì)片層排列不規(guī)則，類囊體逐漸消失，膜系統(tǒng)破壞明顯，細(xì)胞器損傷嚴(yán)重甚至解體（圖1）。

重金屬破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，使植物葉片葉綠素含量降低，降低光合強(qiáng)度，這是重金屬對(duì)植物毒害的普遍現(xiàn)象。有研究表明，葉綠體類囊體膜含不飽和的脂肪酸，因而對(duì)活性氧誘發(fā)的膜脂過(guò)氧化特別敏感，當(dāng)體內(nèi)積累的Cd2+增多，使葉綠體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧過(guò)多而來(lái)不及清除，引發(fā)膜質(zhì)過(guò)氧化，使葉綠體膜結(jié)構(gòu)受到損傷，從而影響其功能[7]。宇克莉[8]等人研究認(rèn)為，Cd2+脅迫下葉綠體膨脹成圓球形，可能是Cd2+導(dǎo)致滲透壓的變化引起的?？梢妼?duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)的破壞作用是重金屬Cd對(duì)植物毒害的機(jī)制之一。

2.2 Cd2+對(duì)水芹幼苗葉綠素含量的影響 圖2表明，葉綠素a和總?cè)~綠素含量在1mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，說(shuō)明低濃度鎘對(duì)葉綠素的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，葉綠素a/葉綠素b隨著Cd2+濃度的變化與葉綠素a變化一致。當(dāng)Cd2+濃度升為2、5mg·L-1時(shí)，與最大含量相比，葉綠素總量和葉綠素a均顯著下降，同時(shí)與葉綠素a一致，葉綠素a/葉綠素b也顯著下降（P<0.05）。Somashekaraiah[9]等研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致葉綠素下降原因可能是重金屬影響葉綠素合成酶活性，也可能與葉綠素中Fe競(jìng)爭(zhēng)作用[10]，還可能是促進(jìn)葉綠素本身降解[11]，從而影響了葉綠素含量。其中葉綠素總量和葉綠素a下降速率大于葉綠素b，說(shuō)明葉綠素a對(duì)Cd2+更敏感。葉綠素a/葉綠素b比值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是因?yàn)槿~綠素a下降速率大于葉綠素b。

2.3 Cd2+對(duì)水芹幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響 由表1可知，與對(duì)照組比較，在Cd2+濃度逐漸增高條件下，水芹葉片中MDA、H2O2、O2·-含量均顯著上升（P<0.05），當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到10mg·L-1，增幅分別為166.67%、77.09%和85.90%。SOD與Cd2+濃度呈現(xiàn)反比例關(guān)系，而POD、CAT活性在整個(gè)濃度梯度中均表現(xiàn)為先上升后下降。有研究表明，在低濃度Cd2+能夠促進(jìn)植物代謝途徑，而高濃度則抑制酶活性[12]，導(dǎo)致代謝活性氧功能下降[13]。SOD、POD和CAT活性在0.2mg·L-1達(dá)到最大時(shí)，增幅分別為109.68%、和64.71%和40.29%，而在10mg·L-1時(shí)，CAT僅僅是對(duì)照組67%，這與周紅衛(wèi)[14]和馬劍敏[15]等人研究一致。研究顯示，低濃度Cd2+能使SOD、POD和CAT活性逐漸增加；高濃度Cd2+下，SOD起主要的保護(hù)作用，而POD和CAT的保護(hù)程度較低[16]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，葉綠素含量的變化與葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化之間有一定的關(guān)系。在低濃度Cd2+處理下，葉綠體結(jié)構(gòu)沒(méi)有受到明顯損傷，此時(shí)的葉綠素含量與對(duì)照組相比也沒(méi)有明顯變化；隨著Cd2+濃度的升高，葉綠體超微結(jié)構(gòu)逐漸受到破壞，主要表現(xiàn)為葉綠體膨脹成圓球形，葉綠體空泡增多，基質(zhì)片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少、排列不規(guī)則等現(xiàn)象。在Cd2+濃度達(dá)到2、5mg·L-1時(shí)超微結(jié)構(gòu)顯示，膜系統(tǒng)邊緣逐漸不清晰，葉綠體空泡體積加大，基質(zhì)片層、基粒類囊體呈現(xiàn)逐漸壓縮減少；而當(dāng)Cd2+濃度升為2、5mg·L-1時(shí)，與最大含量相比，葉綠素總量和葉綠素a均顯著下降。葉綠素a對(duì)Cd2+敏感性大于葉綠素b，在Cd2+濃度逐漸增高條件下，水芹葉片中MDA、H2O2、O2·-含量均顯著上升（P<0.05），SOD與Cd2+濃度呈現(xiàn)反比例關(guān)系，而POD、CAT活性在整個(gè)濃度梯度中均表現(xiàn)為先上升后下降。

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（責(zé)編：張宏民）