王源秀等

摘 要：在生物化學實驗本科教學實踐中，分別應(yīng)用2，6-二氯酚靛酚滴定法、磷鉬酸法和紫外分光度計法測定果蔬中的VC含量，從試劑配制、實驗操作過程以及實驗結(jié)果幾個方面對這3種方法進行了比較。結(jié)果表明，紫外分光光度法測定果蔬VC含量最為簡便、精確，可作為《生物化學實驗》教學中“常見果蔬VC含量測定”實驗的操作方法。

關(guān)鍵詞：VC；測定；二氯酚靛酚滴定法；磷鉬酸法；紫外分光度計法

中圖分類號 TS255 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）18-20-04

Exploration of the Methods by Quantitative Determination of VC in Common Fruits and Vegetables

Wang Yuanxiu et al.

（College of Life Science，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China）

Abstract：In the undergraduate teaching of “Biochemistry Experiment”，students tried to determine the content of VC in different kinds of fruits and vegetables using threemethods（themethod by 2，6-dichloro-indophenol titration，themethod by phosphomolybdic acid and themethod by UV spectrophotometer）.We compared threemethods roundly from the reagent preparation，experimental operation process and the experimental results.We ensured that themethod by UV spectrophotometer was themost simple and the students could get themost accurate results using it，so we choose it as the operationmethod in the teaching of “the determination of the content of VC in common fruits and vegetables " in “Biochemistry Experiment "

Key words：Vitamin C；Determination；Themethod by 2，6-dichloro-indophenol titration；Themethod by phosphomolybdic acid；Themethod by ultraviolet spectrophotometermethod

生物化學實驗是本科生物類專業(yè)學生的必修課程，“VC的定量測定”是其中的備選經(jīng)典實驗之一，以往多采用2，6-二氯靛酚滴定法[1]進行實驗教學；該方法雖操作簡單，儀器及試劑廉價，但學生操作過程中易出現(xiàn)滴定管滲漏現(xiàn)象，且在使用含有色素試材時，會導致滴定終點難以判定，結(jié)果不精確。因此該方法已不適合現(xiàn)代生化實驗教學的需要。

“VC的定量測定”除2，6-二氯靛酚滴定法方法之外，目前使用較多的主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法、鉬藍比色法、原子吸收法、碘量法、電位滴定法、熒光光度法[2-10]。其中原子吸收法、高效液相色譜法和熒光光度法儀器相對昂貴；碘量法和電位滴定法操作步驟較繁瑣，且受其它還原性物質(zhì)、樣品色素顏色和測定時間的影響，不適合作為本科生化實驗教學。

為了培養(yǎng)創(chuàng)新型人才，生化實驗教學需要引入“研究性”實驗，對“VC的定量測定”實驗進行調(diào)整，如可改為“常見果蔬VC含量測定”[11]。由于《生物化學實驗》是專業(yè)基礎(chǔ)課，每個實驗需供300以上的學生來做，這就需要實驗方法簡單易行，試劑試材廉價，并且能獲得較準確的實驗結(jié)果。為此，筆者對3種實驗室常用的測定VC含量的方法，即二氯酚靛酚滴定法、磷鉬酸法和紫外分光度計法，進行了對比試驗，以期能找到適合實驗教學的易于操作的定量測定VC的方法。

1 實驗材料、儀器和試劑

1.1 實驗材料 新鮮的番茄、橘子、青椒、棗子、蘋果，購買于蕪湖市銀湖南路沃爾瑪超市。

1.2 實驗儀器 紫外-可見分光光度計（WJ 7200型，上海尤尼克儀器有限公司）、酸式5mL微量滴定管、磁力攪拌器（79HW型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）、打漿機（MJ-BL25C3，廣東美的生活電器制造有限公司）、離心機（KDC-40型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、恒溫水浴鍋（DK-S24型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、研缽、容量瓶。

1.3 實驗試劑 草酸、2，6-二氯酚靛酚、抗壞血酸（VC）、鉬酸銨、EDTA、硫酸、乙酸、偏磷酸、HCl、NaOH，均為分析純。

2 實驗方法

二氯酚靛酚滴定法和磷鉬酸法的具體實驗原理、實驗器材、試劑、操作步驟和數(shù)據(jù)分析參考文獻1。紫外分光光度法的具體實驗原理、實驗器材、試劑、操作步驟和數(shù)據(jù)分析參考文獻2。樣品測定時設(shè)置3個重復。

3 結(jié)果與分析

3.1 二氯酚靛酚滴定法 由圖1可知，采用二氯酚靛酚滴定法獲得的5種果蔬VC的含量分別為：蘋果0.69mg/100g，番茄3.20mg/100g，橘子10.95mg/100g，青椒28.83mg/100g，棗子131.65mg/100g，其中棗子的VC含量最高，蘋果的VC含量最低。

利用二氯酚靛酚滴定法測定果蔬的VC含量，使用的試劑種類少（需3種），步驟簡單，只有操作酸式微量滴定管時略微復雜，適合本科生操作。但學生在操作滴定管時，時常更換操作人，且部分學生對滴定管操作陌生，會導致滴定管滲漏；二氯酚靛酚滴定時，滴定終點為微粉紅色，而某些果蔬（如橘子、西紅柿）色澤鮮亮，呈偏紅色，對滴定終點的判斷影響顯著，要想得到準確的結(jié)果，需要采用反滴定法[8]，使操作變復雜；另外2，6-二氯酚靛酚試劑價格昂貴。

3.2 磷鉬酸法 采用磷鉬酸法定量測定VC，其原理是鉬酸銨在一定條件下（硫酸和偏磷酸根離子存在）與VC反應(yīng)生成藍色化合物，在一定范圍內(nèi)，吸光度與濃度成正比。經(jīng)實驗，該藍色化合物在760nm處有最大吸收峰。由圖2可知，VC濃度與760nm處的吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=0.0018x+0.0078，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9933。

由圖3可知，通過磷鉬酸法測得果蔬中VC含量，分別為：蘋果0.79mg/100g，番茄5.55mg/100g，橘子10.32mg/100g，青椒42.29mg/100g，棗子111.52mg/100g，5種果蔬中VC含量的多少順序與用二氯酚靛酚滴定法測得到結(jié)果一致，即棗子>青椒>橘子>蘋果>番茄。

在用磷鉬酸法測定果蔬的VC含量，步驟簡單，但所需試劑種類較多（需7種，見實驗方法），且需學生提前學會標準操作分光光度計；在實際操作中發(fā)現(xiàn)，所有試劑（標準VC溶液、草酸-EDTA、偏磷酸-乙酸、硫酸、鉬酸銨）按比例混合后，混合液在30℃水浴時易變渾濁，形成黃色沉淀，如果操作不熟練，時間略長后，黃色沉淀會附著在分光光度計的比色皿上，難以清洗。

3.3 紫外分光光度法 紫外分光光度法是利用VC對紫外產(chǎn)生吸收和對堿不穩(wěn)定的特性，于243nm處測定樣品液與堿處理樣品液兩者吸光度之差，通過標準曲線方程，即可計算樣品中VC的含量。由圖4可知，紫外分光光度法中，VC的含量在1.0～12.0μg/mL濃度范圍內(nèi)，其濃度與紫外吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A=1.8275x-0.0042，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

由圖5可知，通過紫外分光光度法測得果蔬中VC的含量分別為：蘋果10.00mg/100g，番茄12.50mg/100g，橘子17.50mg/100g，青椒114.78mg/100g，棗子150.00mg/100g。該方法測得的各種果蔬的VC含量比前2種方法測得的VC含量存在顯著差異，即該方法測得的各種果蔬的VC含量比較高，其中差異最小的是棗子，但也高出14%（與二氯酚靛酚法相比）。

利用紫外分光光度法測定果蔬的VC含量，所使用的試劑種類少（需3種）且廉價，步驟簡單易行，適合本科生操作。但需學生提前學會標準操作紫外分光光度計；而且紫外光敏感，需準確調(diào)試；另外紫外分光光度計略昂貴。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論 3種方法測得5種果蔬中VC含量的大小順序均為：棗子>青椒>橘子>蘋果>番茄。以《中國食物成分表2012》為參考，由圖6可知，紫外分光光度法測得果蔬中VC含量與參考數(shù)據(jù)最接近，由二氯酚靛酚滴定法測得水果中VC含量與參考數(shù)據(jù)偏差較大[12]。

4.2 討論 將3種方法的各具體操作事項進行比較，如表1所示。二氯酚靛酚滴定法的所用試劑VC、草酸和2，6-二氯酚靛酚，這些試劑配制簡單，但2，6-二氯酚靛酚溶液不穩(wěn)定，需在棕色瓶中冷藏，且只能用7d；試劑標定復雜；使用滴定管不當，易滲漏，滴定終點不易判斷，易受試材色素影響，而整個操作過程要迅速，防止還原型VC被氧化；滴定過程一般不超過2min，如果時間沒有把握好，則影響實驗結(jié)果?？偟膩碚f，該法產(chǎn)生誤差的因素多，不易測得精確數(shù)據(jù)。磷鉬酸法所用試劑繁多（7種），且不易配制。對于實驗操作熟練者，該法操作過程簡便，能得到較精確的標準曲線和實驗結(jié)果。但對于不熟練者，實驗過程耗時較長，就會出現(xiàn)黃色沉淀，影響操作和實驗結(jié)果。紫外分光光度法所用試劑種類少（標準VC、草酸和NaOH），且價格低廉，易配制。該法操作步驟簡便，但是實驗過程中需要嚴格控制反應(yīng)時間和正確使用紫外分光光度計。對于操作者，只有認真仔細，基本可測得較精確的實驗結(jié)果。

綜上所述，紫外分光光度法可選為“生物化學實驗”教學的操作方法，用于測定不同果蔬VC含量，過實踐教學試用也證實該法切實可行[11]。在具體實踐教學中，“常見果蔬VC含量測定”屬于“綜合研究性”實驗，每小班學生（約20人，分10個小組）需根據(jù)命題事先寫好研究方案，方案通過后進行實驗操作。操作時每小組測定1種果蔬的VC含量，這樣每個小班就可以獲得約10種果蔬的VC含量數(shù)據(jù)，每個小組收集這10種果蔬的VC含量數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析，撰寫研究小論文。通過這個實驗，學生可以提高實驗操作技能，學會數(shù)據(jù)處理和論文寫作的基本方式方法。

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