孫榮嶸

【摘 要】目的：建立兩種濃度水楊酸軟膏微生物限度檢查方法。方法：5%水楊酸軟膏采用常規(guī)法，30%水楊酸軟膏采用培養(yǎng)基稀釋法進行細菌、霉菌及酵母菌計數和控制菌的檢查。結果：計數驗證中各試驗菌的回收率大于70%，控制菌檢查驗證可檢出試驗菌。結論：所建立的兩種濃度水楊酸軟膏微生物限度檢查方法可行。

【關鍵詞】水楊酸軟膏 微生物限度 方法驗證

5%以上濃度的水楊酸軟膏可以促進角質溶解，可用于頭癬、足癬及局部角質增生。依據《中國藥典（二部）》2010年版等文獻[1-2] ，對具有抑菌性的樣品進行微生物限度檢查時，應盡可能消除其抑菌性，才能真實反映樣品被微生物污染的情況。根據兩種水楊酸軟膏中所含水楊酸濃度不同，采取常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法對樣品進行細菌、霉菌及酵母菌計數和控制菌檢查并進行方法驗證試驗。

1材料

1.1 儀器

Nu-425-400E生物安全柜（美國NuAire 公司）；YP-601N電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；PSH-300生化培養(yǎng)箱（中科生命科技有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基及樣品

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號分別為1305223，130523，130708，130814，130618，1306032，130911），以上購于北京三藥科技開發(fā)公司；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號分別為3103272，3103414），以上購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。樣品為5%水楊酸軟膏（批號：150323）、30%水楊酸軟膏（批號：150316），均由濟南市皮膚病防治院提供。

1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63501]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]，由山東省食品藥品檢驗所提供，均為第三代菌種。

2方法與結果

2.1 菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，34 ℃培養(yǎng)18～24 h。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基，26 ℃培養(yǎng)24～48 h ；上述培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉溶液10倍梯度稀釋成每1 mL含50～100 CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)5～7 d，用0.9%氯化鈉溶液將孢子洗脫，用0.9%氯化鈉溶液10倍梯度稀釋成每1 mL含50～100 CFU的孢子懸液。

2.2 供試液的制備

取供試品5g，加到含45 ℃左右溶化的的5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻璃棒攪拌成團后，緩慢加入45 ℃左右的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分乳化，制成1：20供試液。取1：20供試液1 mL加到9 mL的緩沖液中，制成1：200 供試液。

2.3 驗證試驗

2.3.1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

試驗組：①常規(guī)法 試驗組：取1 mL 1：20的供試液和1 mL 50～100 CFU的試驗菌，同時注入平皿中，立即加入相應培養(yǎng)基，細菌于34 ℃培養(yǎng)3 d并計數，霉菌及酵母菌于26 ℃培養(yǎng)5 d并計數。②培養(yǎng)基稀釋法 取1：20或1：200供試液1 mL，分別置于5個平皿中，使每個平皿含0.2 mL，再加入1 mL 50～100 CFU的試驗菌，照常規(guī)法進行驗證試驗。菌液組：測定所加入的每一種試驗菌菌數。供試品對照組：按試驗組的方法和條件測定供試品的本底菌數。稀釋劑對照組：用相應的稀釋液代替供試品溶液，按試驗組的方法，加入1 mL 50～100 CFU的試驗菌，測定其菌數。各試驗菌的平均回收率結果見表1。

結果表明：5%水楊酸軟膏對5種試驗菌的回收率均高于70%，可以采用常規(guī)法進行細菌、霉菌及酵母菌計數檢查。30%水楊酸軟膏采用常規(guī)法，對5種試驗菌的回收率均低于70%，表明30%水楊酸軟膏不能采用常規(guī)法進行細菌、霉菌及酵母菌計數檢查，可采用培養(yǎng)基稀釋法（1：200供試液，0.2 mL/皿）進行細菌、霉菌及酵母菌計數檢查。

2.3.2 控制菌檢查方法驗證

試驗組：①常規(guī)法 取1：20的供試液20 mL及1 mL50～100 CFU的金黃色葡萄球菌菌液或銅綠假單胞菌菌液，加到100 mL的營養(yǎng)肉湯或膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h后，照2010年版《中國藥典》二部控制菌檢查方法進行檢查。②培養(yǎng)基稀釋法 取1：20的供試液20 mL及1 mL50～100 CFU的金黃色葡萄球菌菌液或銅綠假單胞菌菌液，加到200 mL或400 mL的營養(yǎng)肉湯或膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，照試驗組進行試驗。陰性對照組：取1：20的供試液20 mL及1 mL50～100 CFU的大腸埃希菌菌液，同試驗組方法和條件進行試驗，陰性對照菌應不得檢出。試驗結果見表2。

結果表明：5%水楊酸軟膏可采用常規(guī)法進行控制菌檢查。 30%水楊酸軟膏可采用培養(yǎng)基稀釋法進行控制菌的檢查，其中，銅綠假單胞菌的檢查采用取1：20的供試液20 mL 加到200 mL增菌液的方法，金黃色葡萄球菌的檢查采用取1：20的供試液20 mL 加到400 mL增菌液的方法，試驗組均檢出相應的試驗菌，陰性對照組未檢出陰性對照菌。

3討論

在對軟膏進行微生物限度檢驗時，需要掌握好乳化劑、加入平皿前供試液以及注入相應培養(yǎng)基的溫度，均應控制在45℃左右，否則供試品容易在平皿中形成乳白色的塊狀物，影響菌落計數[3]。由于軟膏劑的特殊性，處理起來較為繁瑣，因此為建立快速有效的微生物限度檢查方法，在對軟膏進行微生物限度檢查時，應盡量采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典：二部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄 107-116.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351-389.

[3]方李，張心悅，吳晶晶 等.13種軟膏劑微生物限度檢查的方法驗證探討[J].中國藥師，2014：17（9）：1580-1583.