王永娟　王岑　朱善元　左偉勇

摘要：無菌采取鵝外周血并進行抗凝處理，以全血提取法、細胞分離直接提取法、細胞分離培養(yǎng)提取法及細胞分離誘導(dǎo)提取法分別提取外周血中淋巴細胞的總RNA；紫外分光光度計檢測總RNA的純度和得率；以總RNA為模板通過RT-PCR法擴增鵝α-干擾素（GoIFN-α）基因，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEMT-α，通過比較GOIFN-α序列確定各種提取方法的可行性。結(jié)果顯示，4種方法提取的RNA純度高，均可作為模扳擴增出目的基因，滿足后續(xù)的分子生物學(xué)研究；其中以細胞分離直接提取法制備的RNA產(chǎn)量最多，此結(jié)論為外周血淋巴細胞總RNA的提取提供了一種更快捷的方法。

關(guān)鍵詞：外周血；淋巴細胞；RNA提?。籖T-PCR；方法比較；鵝；干擾素

中圖分類號：S858.33 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0204-02

干擾素是真核細胞對各種刺激作出反應(yīng)而自然形成的一組復(fù)雜且具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。刺激產(chǎn)生干擾素的外源因素主要有病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，如植物血凝素（PHA）、刀豆素（ConA）。在外源因素刺激下，原處于Go期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，從而獲得豐富的含有絲分裂且生長活躍的細胞群體，終止分裂中期的淋巴細胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，即可得到1個表達細胞因子的cDNA庫。多個報道顯示，為獲取目的基因，一般在外源因素刺激后再提取外周血淋巴細胞總RNA，本研究嘗試采用多種方法制備總RNA并擴增目的基因，以探索一種最為快捷簡便的外周血淋巴細胞總RNA提取方法，為其他細胞因子的分離奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1試驗材料

成年揚州白鵝購自揚州瑞農(nóng)科技有限公司；刀豆球蛋白（conA）購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；禽淋巴細胞分離液購白天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase、RNaseInhibitor、TaqDNA聚合酶、1kbDNALadderr、PrestainedProtein分子量marker、pGEM-TEasyVectorSystem、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Promega公司；膠回收試劑盒、細胞培養(yǎng)液、細胞消化液、DH5cα大腸桿菌感受態(tài)細胞購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)已發(fā)表的GoWN-α基因序列（登錄號：HQll5583）設(shè)計1對引物，擬擴增的全長序列為576bp。引物F1：5'-ATGCCTGGGCCATCAGCCCCAC-3'和R1：5'一TTAGCGCAT—GGCGCGGGTGAGG-3'由上海Invitrogen公司合成。

1.3總RNA提取

1.3.1細胞分離誘導(dǎo)提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，加入含10%小牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液并吹勻，計數(shù)后稀釋至2×10⁶個/mL。用終濃度64mg/LConA刺激誘導(dǎo)，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，收集細胞并按Trizol試劑說明書提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.3.2細胞分離培養(yǎng)提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翅靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，后將其重懸于含10%小牛血清的RPMI一1640細胞培養(yǎng)液中，計數(shù)后稀釋至2×10⁶。個/mL，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按Trizol說明書提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.3.3細胞分離直接提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按淋巴細胞分離液說明書分離淋巴細胞，用PBS重新懸浮，反復(fù)洗滌2～3次后按Trizol說明書提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.3.4全血提取總RNA使用無菌注射器采取鵝翼靜脈血5mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。按Trizol說明書直接提取總RNA，通過紫外分光光度儀測其純度和濃度。

1.4GoIFN-α基因的RT-PCR擴增

GOIFN-α基因的反轉(zhuǎn)錄（RT）：取上述4種RNA懸浮液各5μL，參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書，均選用特異性引物R1分別合成cDNA第1鏈，RT產(chǎn)物各自標記岳于20℃保存。

GolFN-α基因的PCR擴增：取上述4種RT產(chǎn)物各2μL為cDNA模板，分別加入MixTaqDNA聚合酶25μL，上、下游引物（F1、R1）各1μL，超純水補足至各反應(yīng)體系均50μL，混勻后參照下列反應(yīng)程序進行PCR擴增。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，28個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物各取5μL經(jīng)1.0%瓊脂糖凝皎電泳初步鑒定片段大小。

1.5Gol-α基因的克隆與鑒定

將上述4種經(jīng)凝皎電泳鑒定后的PCR產(chǎn)物用皎回收試劑盒純化回收，并分別與pGEMT-easy載體進行連接，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5c～感受態(tài)細胞后進行藍白斑試驗，提取重組質(zhì)粒并作酶切鑒定。將陽性GoLFN-α全基因重組質(zhì)粒送至上海立菲生物技術(shù)公司測序。

2.結(jié)果與分析

2.1總RNA純度與濃度測定

紫外分光光度儀分別測定4種不同方法提取的總RNA純度和濃度，結(jié)果見表1，其中D260nm/D280nm值反映總RNA的純度。

2.2GoLFN-α全基因的擴增

對上述4種方法所得的揚州鵝外周血總RNA，采用體積及反應(yīng)條件完全相同的反應(yīng)組分進行反轉(zhuǎn)錄。之后在相同條件下進行全長GolFN-α基因的PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，均獲得了符合預(yù)期大小的約576bp的條帶（圖1）。endprint

2.3GoLFN-α全基因克隆與鑒定

將各PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體，分別用限制性內(nèi)切酶SalI或EcoRI對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)

1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2（以細胞分離直接提取法所得GolFN-α基因重組為例），均出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pGEMT-α。

2.4GolFN-α基因序列測定

將各種方法所對應(yīng)的重組質(zhì)粒pGEMT-α>送至上海立菲生物技術(shù)公司測序，結(jié)果見表2-4種方法制備的GoLFN-α序列同源性為100.0%，與參考序列的同源性為99.7%。

3.結(jié)論與討論

本研究通過4種方法制備鵝外周血淋巴細胞總RNA并擴增目的基因GolFN-α，結(jié)果顯示，各種方法所制備的總RNA均可擴增出預(yù)期的目的基因，其中以“細胞分離直接提取法”所得總RNA濃度最高，同等條件下所得目的基因產(chǎn)量也最多。此結(jié)果提示我們：從外周血淋巴細胞中分離細胞因子，可以避開以往的細胞分離誘導(dǎo)提取法，改用無需誘導(dǎo)劑的細胞分離直接提取法，既高效又快捷，且能滿足后期的分子生物學(xué)研究。另外，全血提取法在不分離淋巴細胞的情況下直接提取，同樣獲得了目的基因，因此在對目的基因無產(chǎn)量要求的情況下全血提取法也是很好的選擇。

本研究中的全血提取法、細胞分離培養(yǎng)提取法及細胞分離直接提取法均未涉及到淋巴細胞的誘導(dǎo)，但卻成功獲得了目的基因，究其原因可能是所采鵝已受到外來病毒的感染，外周血淋巴細胞已轉(zhuǎn)化為具有分化能力的淋巴母細胞，因此，分離的外周血細胞就算沒有刺激也可以達到預(yù)期目的。其中細胞分離直接提取法，淋巴細胞已從全血中分離出來卻又未經(jīng)培養(yǎng)，淋巴細胞密度大、活性高，因此同等條件下總RNA和目的基因產(chǎn)量均最高。而全血提取法可能含其他細胞RNA量較多，故出現(xiàn)總RNA產(chǎn)量高、目的基因產(chǎn)量不高的局面。

本研究各種方法獲得的GolFN-α基因序列與GenBank中已發(fā)表的GolFN-α基因序列（登錄號：HQll5583）同源性達99.7%，說明該基因相對保守，證實了禽IFN-α基因序列保守性良好、遺傳進化變異緩慢的觀點。

綜上所述，細胞分離直接提取法可以替代甚至優(yōu)于之前常用的誘導(dǎo)法以實現(xiàn)畜禽細胞因子的分離擴增；全血提取法操作簡單，在對目的基因無產(chǎn)量要求的情況下也可運用。endprint