黃　娟　羅運春★

Galectin-3在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用及低分子柑桔果膠的干預

黃娟羅運春★

目的 探討小鼠肺組織半乳糖凝集-3（Galectin-3）表達水平及其與支氣管哮喘的關系，研究低分子柑桔果膠（LCP）對哮喘小鼠肺組織Galectin-3表達及TH1/TH2平衡的影響。方法 用卵清白蛋白建立哮喘模型。將BALB/c小鼠隨機分為五組：正常對照組（A組）、哮喘組（B組）、低分子柑桔果膠預防組（C組）、低分子柑桔果膠治療組（D組）和地塞米松治療組（E組），每組10只。留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行細胞總數計數和分類計數；應用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗方法檢測BALF中ⅠL-4、ⅠFN-γ濃度，采用免疫組化和RT-PCR法分別檢測Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA的表達。結果 哮喘組肺組織中 Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA表達的強度均高于對照組，LCP預防組和治療組均顯著低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。Galectin-3及其mRNA表達與BLAF中的ⅠL-4濃度成顯著正相關（r=0.791、0.761，P＜0.01），而與BLAF中的ⅠFN-γ濃度成顯著負相關（r=-0.668、0.634，P＜0.01）。結論 哮喘小鼠肺組織Galectin-3高度表達，參與氣道炎癥的發(fā)生，LCP干預后下調Galectin-3表達，糾正Th1/Th2失衡。

哮喘 半乳糖凝集素-3 ⅠL-4 ⅠFN-γ 低分子柑桔果膠

半乳糖凝集素（Galectin）是一類能選擇性識別糖結構并與之非共價結合的蛋白質，廣泛分布于細胞表面、胞質、胞核及細胞外基質中。研究顯示，半乳糖凝集素3（Galectin-3）可能與支氣管哮喘的發(fā)病機制密切［1～3］。改良柑橘果膠（MCP）又稱低分子柑桔果膠（LCP），其主要成分是半乳糖，能競爭抑制體內的Galectin-3配體，有效封閉和阻斷Galectin-3的功能表達。作者通過建立哮喘小鼠模型，采用免疫組化和RT-PCR技術，檢測Galectin-3在氣道和肺組織中的表達，同時采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）對外周血中白細胞介素4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）的含量進行測定，觀察LCP對Galectin-3蛋白、mRNA及TH1/TH2平衡的影響，為哮喘發(fā)病機制及防治開辟新的思路。

1　材料與方法

1.1小鼠哮喘模型的建立 SPF級BALB/c雄性小鼠50只（由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供），21～35d，體重14～18g，隨機分為正常對照組（A組）、哮喘組（B組）、LCP預防組［LCP粉2400mg/（kg.d）］（C組）、LCP治療組［LCP粉2400mg/（kg·d）］（D組）和地塞米松治療組（0.5mg/kg）（E組）。每組10只。采用V級OVA制備模型，哮喘模型的制作參照文獻［4］的方法略作改進。分致敏、激發(fā)兩個階段，LCP預防組分別于第1天開始每天AM 8：30按2400mg/kg灌胃LCP；第8天和第21天腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al（OH）3凝膠致敏，各一次，共2次，第32天開始使用空氣壓縮霧化器向置于密閉有機玻璃容器內的小鼠噴霧1%OVA，每天吸入30min，連續(xù)定時激發(fā)1周。LCP治療組于激發(fā)前每天AM 8：30按2400mg/kg灌胃LCP。地塞米松治療組于每次激發(fā)前1h按0.5mg/ kg腹腔注射地塞米松液0.1ml。對照組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。

1.2 實驗方法 各組末次激發(fā)24h內處死，眼球動脈取血，收集血清，每只小鼠左肺迅速留取肺組織，部分透明，石蠟包埋連續(xù)切片，用以光電鏡標本制作和免疫組化，右肺進行支氣管肺泡灌洗并留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）經2000rpm/min離心15min，取上清液-80℃ Eppendorf管保存用以檢測IFN-γ和IL-4濃度。支氣管肺泡灌洗小鼠收取BALF，細胞分類計數使用瑞士染色。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定BALF中IFN-γ、IL-4濃度，測定方法按試劑說明書進行操作。

1.3RT-PCR法測肺組織Galectin-3 mRNA的表達 引物設計和合成：檢索GenBank數據庫中mouse Galectin-3、GAPDH的mRNA序列，由上海基康生物工程有限公司設計并合成引物，Galectin-3：F 5，CCCGCATGCTGATCACAA 3，R 5 GGAGGTTCTTCATCCGATGGT 3；GAPDH F 5 CAAGTTCAACGGCACAGTCAA 3；R 5 TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC 3.

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。數據以（±s）表示。組間均數比較采用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett'T3檢驗，兩變量的相關采用Pearson相關分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1HE染色觀察 哮喘組小鼠肺組織切片HE染色可見肺內支氣管黏膜下、肺內支氣管及血管周圍較多炎性細胞浸潤，以EOS、Lym、Neu為主，黏膜下水腫，黏液腺增生，黏膜皺折增多，氣道上皮多處斷裂和上皮細胞脫落，肺間質和支氣管腔內可見炎性細胞滲出和分泌物，支氣管壁略顯增厚和基底膜輕度增厚且不規(guī)則，細支氣管平滑肌輕度肥大。LCP預防組、治療組及地塞米松治療組小鼠肺組織炎性細胞浸潤等病理改變較哮喘組減輕。

2.2PAS染色觀察 正常對照組小鼠肺組織切片PAS染色未見黏液分泌；哮喘組PAS染色可見氣道上皮杯狀細胞增生肥大，大量黏液形成，并可見氣管腔內黏液栓；LCP預防組、治療組及地塞米松治療組肺組織PAS染色與哮喘組比較，杯狀細胞增生不明顯，黏液分泌明顯減少。

2.3電鏡觀察 正常對照組小鼠顯示正常肺泡Ⅱ型上皮細胞（可見板層小體）支氣管纖毛上皮細胞纖毛排列齊整，肺泡隔結構正常，表面微絨毛豐富；未見淋巴細胞及嗜酸性粒細胞附壁及浸潤；肺細小動脈內膜、中膜、外膜清晰，內皮細胞扁平，平滑肌細胞之間有散在的膠原纖維，哮喘組小鼠電鏡觀察顯示肺間質有EOS浸潤，肺泡Ⅱ型上皮細胞水腫，核輕度固縮，胞漿部分內質網擴張，表面微絨毛部分脫落，線粒體輕度腫脹。支氣管纖毛上皮細胞纖毛排列稀疏，有斷裂、融合現象；肺泡腔及血管壁有多個巨噬細胞浸潤。

2.4各組小鼠BALF中細胞計數與分類計數的比較 見表1。

表1　各組小鼠BALF中細胞總數和分類計數（±s）

表1　各組小鼠BALF中細胞總數和分類計數（±s）

注：與A組比較*P＜0.01；與B組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別鼠數細胞總數（×107/L）細胞分類計數（%）LymNEUMфEOS A組1022.40±1.06.35±0.955.13±0.4898.75±.6.230.61±.0.03 B組10100.28±2.24*11.61±0.35*11.87±0.48*66.90±9.75*11.33±.0.72* C組858.40±4.43*△△9.80±1.14*8.91±1.26*△70.54±10.81*6.31±.0.32*△D組991.43.± 5.48*15.36±3.01*10.15±.1.01* 67.78±8.54*8.85±.1.39*△E組1037.73±2.67*△△8.87±0.68*△△8.81±0.97*△80.42±2.38*△2.51±.0.32*△△

2.5各組BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化 見表2。

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

注：與A組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較△P＜0.05

組別鼠數（只）IFN-γIL-4 A組818.85±7.3237.14±3.70 B組86.20±4.38**148.87±30.90** C組89.42±4.69**75.54±10.03**△D組87.24±3.21**98.40±28.80* E組88.65±3.39**72.42±7.96**△F值6.8634.60

2.6肺組織中Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA的變化 見表3。

表3　各組小鼠肺組織Galectin-3蛋白表達情況（±s）

表3　各組小鼠肺組織Galectin-3蛋白表達情況（±s）

注：與A組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別鼠數（只）Galectin-3蛋白Galectin-3 mRNA A組100.18±0.030.20±0.07 B組100.32±0.01**0.39±0.01** C組80.25±0.01**△△0.34±0.01*△△D組90.29±0.01**△0.34±0.03*△E組100.22±0.02**△△0.29±0.01△△F值80.9138.82

RT-PCR顯示肺組織Glectin-3 mRNA表達：B組高于A組（P＜0.01），C、D、E組均低于B組（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）。相關分析顯示，肺組織中Galectin-3、Glectin-3 mRNA含量與BALF中IL-4濃度分別成正相關［（r=0.791，P＜0.01），（r=0.761，P＜0.01）］；而Glectin-3 mRNA含量與BALF中IFN-γ濃度成負相關［（r=-0.668，P＜0.01，（r=-0.634，P＜0.01）］。

3　討論

支氣管哮喘是全球范圍內威脅公眾健康的最常見慢性呼吸道疾病，發(fā)病機制還未完全明確。近年來Galectin在哮喘中的作用逐漸引起重視，已成為探討哮喘發(fā)病機制及治療的新方向。

Galectin屬于可溶性免疫調節(jié)蛋白，能通過調節(jié)信號通路在胞內發(fā)揮作用，或作為生物活性調節(jié)介質在胞外發(fā)揮作用，在炎性反應、細胞凋亡、細胞粘附和腫瘤轉移等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［5］Galeetin-3是這個家族最具特征的成員，由一個長的N末端結構域（調節(jié)區(qū)）和C末端的單一糖識別域（CRD結構域），其羧基端是糖識別域組成。它是一種多效蛋白，主要表達于上皮細胞、樹突狀細胞及各種炎癥細胞中［6］。Cecilia等［7］報道支氣管哮喘患者Galectin-3主要高表達在氣道上皮細胞，腺上皮，內皮細胞，成纖維細胞和平滑肌細胞。其通過與其糖結合物配體等結合，使得其N末端調節(jié)區(qū)形成寡聚化參與調節(jié)細胞粘附，細胞增殖、單核巨噬細胞趨化、內皮細胞和血管生成及信號傳導等。其它機制包括通過結合這些細胞表面的肽聚糖激活多種類型炎癥細胞釋放炎癥介質。外源性的Galectin-3與T細胞表面的糖蛋白結合，可直接介導T細胞的死亡［1］。Zuberi等［8］研究發(fā)現Galectin-3基因敲除（Lgals3-/-）急性哮喘小鼠模型，顯示出明顯降低的氣道炎癥和氣道高反應性，嗜酸性粒細胞浸潤和杯狀細胞生成亦明顯減少。Xiao等［2］進一步研究發(fā)現Galectin-3基因敲除的慢性哮喘小鼠模型顯示出氣道重塑明顯受抑制，主要表現在嗜酸性粒細胞聚集減少，IL-5 和 IL-13表達下調，嗜酸細胞活化趨化因子（eotaxin）、轉化生長因子（TGF-b1）及血管生成介質明顯減少。作者通過BALF中細胞總數和分類計數發(fā)現由OVA激發(fā)的支氣管哮喘小鼠模型嗜酸性粒細胞計數明顯增高，免疫組化和RT-PCR觀察哮喘小鼠肺組織Galectin-3的表達明顯增高，主要表達于氣道上皮細胞及散在的炎性細胞，與文獻報道一致。Galectin-3表達與BALF細胞總數、嗜酸粒細胞百分比、IL-4濃度的濃度呈正相關變化。說明哮喘氣道上皮細胞和肺組織Galectin-3的過度表達很可能是導致哮喘氣道炎性細胞募集和炎性介質分泌增多的主要原因。從而證實Galectin-3參與哮喘發(fā)病機制。因此，探討如何通過藥物抑制肺組織Galectin-3的高表達對調控哮喘氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展有重要價值。

柑桔果膠（CP）是從柑橘類植物細胞壁中提取的一種支鏈天然多糖，其主要成分是半乳糖，LCP則是CP經過特定Ph值和溫度處理后，分支結構減少，更富含半乳糖和糖鏈結構的產物［3］。CP和LCP自身對細胞Galectin-3的表達和分泌無影響。LCP作為Galectin-3的高親和力配體與Galectin-3的CRD作用，競爭抑制體內的Galectin-3配體［9］。此外由于其分子量小，無抗原性，無毒性，水溶性好，容易被胃腸道吸收而進入血液系統(tǒng)發(fā)揮作用，對機體的特異性和非特異性免疫產生影響 。PlattD 等［9］通過體外細胞凝集試驗和細胞粘附試驗證實，LCP可通過封閉細胞表面的galectin-3而抑制細胞間的相互識別和粘附功能。目前國內外已用于腫瘤領域的臨床治療。而在糖尿病、高血脂、鉛中毒等方面的防治也正成為研究的熱點。是否LCP能用于哮喘的防治，目前國內外尚無報道。

本資料首次發(fā)現LCP預防組、治療組肺組織支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤明顯減少，BALF液涂片EOS%較正常組明顯下降，BALF液中IL-4濃度降低；免疫組化和RT-PCR顯示LCP預防組的氣道、肺組織Galectin-3及mRNA表達較哮喘組明顯下降，表明低分子柑橘果膠減輕哮喘小鼠肺部炎癥反應，一定程度上增強Th1免疫反應或抑制亢進的Th2免疫反應，從而改善哮喘發(fā)病機制中Th1/Th2的失衡。其發(fā)生機制可能與上述的競爭抑制體內的Galectin-3配體和自身的免疫調節(jié)有關。本實驗還發(fā)現地塞米松治療組顯著降低的Galectin-3表達，與文獻報道一致［10］，但激素長期治療哮喘的副作用不容忽視。LCP聯合激素治療是否有協(xié)同作用，是否能降低激素的用量是未來研究的方向。LCP無毒性，來源于水果，資源豐富，價格低廉，且不會與藥物發(fā)生化學反應，其開發(fā)應用價值和潛力巨大，望能為哮喘的預防治療開辟新的途徑。

1 Stillman B N， Hsu D K， Pang M， et al . Galectin-3 and Galectin-1 bind distinct cell surface glycoprotein receptors to induce T cell death. J Immunol， 2006，176 （2） ：778～789.

2 Xiao Na Ge， Nooshin S. Bahaie， Bit Na Kang et al. Allergen-Induced Airway Remodeling Is Impaired in Galectin-3 Deficient Mice J Immunol.2010，185：1205～1214.

3 Nangia-Makker P，Hogan V， Honjo Y，et al. Inhibition of human cancer cell growth and metastasis in nude mice by oral intake of modified citrus pectin . J Natl Cancer Inst，2002，94：1854～1862.

4 李昌崇，張維溪，陳小芳，等.巨噬細胞炎性蛋白1及其mRNA在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用.中華兒科雜志，2004，42（2）：90～93.

5 Rabinovich GA， Toscano MA. Turning 'sweet' on immunity： galectinglycan interactions in immune tolerance and inflammation. Nat Rev Immunol， 2009， 9（5）： 338～352.

6 Yang R Y，Rabinovich G A，Liu F T. Galectins： structure，function and therapeutic potential .Expert Rev Mol Med，2008，10：el7.

7 Cecilia C， Johan M， Kristian N. et al. Glycoproteomic identification of galectin-3 and -8 ligands in bronchoalveolar lavage of mild asthmatics and healthy subjects. Biochimica et Biophysica Acta 1820 （2012）1429～1436.

8 Zuberi RI， Hsu DK， Kalayci O， et al. Critical role for galectin-3 in airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma. Am J Pathol， 2004， 165（1）：2045～2053.

9 Platt D， Raz A . Modulation of the lung colonization of B16-F1 melanomacells by citrus pectin J Natl Cance rInst，1992， 84 （ 6 ） ： 438～ 442 .

10 Dabelic S， FlogeI M， Dumic J.Hydrocortisone and dexamethasone affect the galectin-3 expression Period biol，2005，107：175～181.

Objective To evaluate the expression of galectin-3 in mice lung tissue，and to explore the role of galectin-3 in the bronchus of a mouse model of asthma. To access the effect of Low-Molecular-Weight Citrus Pectin（ LCP） on the expression of Galectin-3，Galectin-3mRNA and the level of Th1/Th2 balance. Methods Fifty male BALB/c mice were randomly divided into fi ve groups ： the control group，asthma group，LCP prevented group and LCP treated group and dexamethasone treated group.Ⅰn the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin（ OVA） challenge Methods. Counts of total cell numbers and differentiated cell numbers in bronchoalveolar lavage .The protein expression of Galectin-3 was detected by Ⅰmmuno-histochemistry（ⅠHC）； the mRNA expression of Galectin-3 was detected by transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）. Results Ⅰmmunohistochemical staining and transcriptase polymerase chain reaction showed that the protein content of Galectin-3 and Galectin-3mRNA expression in the lung tissue of asthma group were significantaly higher than that of the control group，while those of LCP prevented group and LCP treated group were signifi cantly lowed than asthma group .（P＜0.05 or P＜0.01）. The Galectin-3 and the Galectin-3mRNA expression had positive correlation with the concentration of ⅠL-4 in BALF.（r=0.791、0.761，P＜0.01） while had negative correlation with the ⅠFN-γin BALF.（r=-0.668、0.634，P＜0.01） Conclusion Galectin-3mRNA and Galectin-3 were strongly expressed in airway and lung of sensitized mouse. LCP can downregulate expression of Galectin-3mRNA，reduce airway infl ammation and modulate Th1/Th2 balance.

Asthma Galectin-3 ⅠL-4 ⅠFN-γ LCP

437000 湖北省咸寧市中心醫(yī)院兒內科（黃娟）

325000 溫州醫(yī)學院附屬育嬰兒童醫(yī)院兒童呼吸科（羅運春）