彭環(huán)慶　彭志允　謝維寧　張志堅(jiān)　唐鐘祥　林輝文

基于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的丹參酮ⅡA治療慢性心力衰竭的機(jī)制研究

彭環(huán)慶彭志允謝維寧張志堅(jiān)唐鐘祥林輝文

目的 研究丹參酮ⅡA（TanⅡA）對慢性心力衰竭（CHF）患者血清損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的影響，探討丹參酮ⅡA治療CHF的作用機(jī)制。方法 利用15%的CHF患者血清損傷正常培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（CRL-1730），用不同濃度的TanⅡA（10、20、40μg/ml）作用于損傷后的細(xì)胞24 h，檢測VEC的活性及細(xì)胞 DNA 的損傷；并檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEC損傷標(biāo)志物循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)（CEC）、血管性假血友病因子（vWF）及血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）的水平變化。結(jié)果 與健康對照組比較，模型組VEC細(xì)胞活性下降（P＜0.05），尾部DNA%、彗星長及尾矩均上升（P＜0.05），CEC、vWF及TM水平均上升（P＜0.05）；與模型組比較，20μg/ml和40μg/ml的TanⅡA能增加內(nèi)皮細(xì)胞的活性（P＜0.05）；減輕DNA的損傷（P＜0.01）；3個(gè)濃度的TanⅡA均可以減少CEC數(shù)（P＜0.05）；20μg/ml和40μg/ ml的TanⅡA可降低 vWF水平（P＜0.05）；40μg/ml的TanⅡA可降低TM水平（P＜0.05）。結(jié)論 TanⅡA能通過減輕CHF患者血清對內(nèi)皮細(xì)胞的DNA損傷保護(hù)VEC，這可能是TanⅡA治療CHF的作用機(jī)制之一。

丹參酮ⅡA 慢性心力衰竭 血管內(nèi)皮細(xì)胞 DNA損傷

我國成年人心力衰竭患者的患病率為0.9%［1］。研究表明慢性心力衰竭（CHF）患者5年內(nèi)病死率高達(dá)50%［2］。隨著對CHF發(fā)病機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的損傷在CHF發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。故保護(hù)CHF患者的VEC及改善其功能，成為治療CHF一條新的途徑。本研究利用CHF患者血清作用于體外培養(yǎng)的VEC，造成細(xì)胞損傷模型，觀察丹參酮ⅡA（TanⅡA）對損傷后的VEC細(xì)胞活性、DNA損傷和循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)（CEC）、血管性假血友病因子（vWF）及血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）的影響，以此探討TanⅡA治療CHF的機(jī)制。報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1一般資料 2013年10月至2014年4月本院門診和住院CHF確診病例40例，其中男21例，女19例；入選患者排除合并急性心功能衰竭及肝腎嚴(yán)重并發(fā)癥。按心功能級別分為：II級24例、III級16例。本院健康志愿者30例作為對照組。兩組均空腹采集前臂靜脈血，予2000r/min離心15min，取其上清液置入EP管，水浴箱滅活（滅活要求：56℃，30min），-20℃凍存?zhèn)溆谩?.2 儀器與材料 凝膠成像系統(tǒng)及酶標(biāo)儀680型（Biorad公司），胎牛血清（Hyclone公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），低熔點(diǎn)瓊脂糖（LMA）及正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA，Promega公司原裝），染色劑SYBR Gold nucleic acid gel stain（Molecule probes 公司），二甲基亞砜（DMSO）及四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）為Sigma公司。1.3 培養(yǎng)基與藥物的配制 （1）培養(yǎng)基：CHF組：15%的CHF患者血清+85%的DMEM。健康對照組：15%的健康者血清+85%的DMEM。（2）TanⅡA的配制：取TanⅡA2mg，溶于50μl的DMSO，制成濃度為40μg/μl的母液，其他濃度的TanⅡA取母液配制。1.4 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)液要求用含10%胎牛血清培養(yǎng)液（pH7.2），培養(yǎng)溫度為37℃（5%CO2及飽和濕度條件）。

1.5實(shí)驗(yàn)分組 VEC接種后分為5組（A、B、C、D、E組），每組培養(yǎng)8孔細(xì)胞；予胎牛血清培養(yǎng)24h后A組加入含15%健康人血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為健康對照組，B～E組加入含15%CHF患者血清的培養(yǎng)基進(jìn)行損傷造模；以上條件培養(yǎng)基作用24h后，C～E組分別加入10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的TanⅡA，A、B組分別加入等量的DMEM培養(yǎng)基作對照，培養(yǎng)24h后檢測指標(biāo)。

1.6細(xì)胞活性檢測（MTT法）TanⅡA作用24h后，各組細(xì)胞采用MTT法檢測細(xì)胞活性（酶標(biāo)儀上490nm處測定吸光值）。

1.7內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷的檢測（單細(xì)胞凝膠電泳法） TanⅡA作用24h后的細(xì)胞約取3×104個(gè)，予2000r/min離心5min，棄上清液，37℃保存，備用；取100μl 1.0% NMA PBS凝膠澆注載玻片，4℃固化（5min）；37℃，取含細(xì)胞的0.6% LMA PBS凝膠75μl滴于第1層NMA上，同前固化；固化完成后浸入細(xì)胞裂解液4℃，2h；于水平電泳槽，高pH電泳緩沖液中浸泡20min；低溫（＜15℃），300mA，25V條件電泳20min；pH7.5、0.4mol/LTris浸洗，5min，共浸洗3次；浸洗完成后予20mg染色劑染色15min，P.A.L.M系統(tǒng)（Axiovert200）進(jìn)行拍照，結(jié)果采用casp-1.2分析軟件分析，每組分析100個(gè)細(xì)胞，取三個(gè)主要指標(biāo)（尾部DNA%、彗星長、尾矩）。

1.8內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物的檢測 CEC檢測：將3ml培養(yǎng)上清液用等量生理鹽水稀釋，加至密度為1.050的Percoll 液2ml中，1500r/min 離心 20min；取Percoll界面以上液體作為上層以及 Percoll 層液體1ml作為中層；取中層震蕩后細(xì)胞懸液少許，滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池中，對全部9個(gè)大格中的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，同一標(biāo)本計(jì)數(shù) 4 次后取平均值。vWF、TM的水平檢測：vWF、TM的水平按照酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)結(jié)果采用（x±s）表示，多組間比較采用隨機(jī)對照單因素析因方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組內(nèi)皮細(xì)胞的吸光度（OD值） 見表1。

表1　各組內(nèi)皮細(xì)胞的OD值（x±s）

2.2內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷指標(biāo)結(jié)果 見表2。

表2　各組細(xì)胞DNA損傷指標(biāo)的結(jié)果（x±s）

2.3內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物檢測結(jié)果 見表3。

表3　各組內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物的變化（x±s）

3　討論

VEC的損傷在CHF的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。CHF時(shí)大量自由基和炎癥細(xì)胞因子的釋放，造成機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞，進(jìn)而使VEC這一靶器官損傷和功能紊亂［3］。VEC損傷之后出現(xiàn)功能的紊亂將會(huì)促進(jìn)CHF的發(fā)展，兩者互為因果，形成惡性循環(huán)。因此要阻止和打斷這種循環(huán)，保護(hù)VEC及改善其功能是關(guān)鍵的一環(huán)。如周鵬［4］的研究表明，前列地爾可改善CHF患者的心功能，同時(shí)可降低VEC損傷標(biāo)志物vWF的水平。

CHF患者VEC受損時(shí)，反映VEC損傷的相關(guān)指標(biāo)將發(fā)生明顯改變，且與心功能分級呈一定的相關(guān)性。目前常用的VEC損傷指標(biāo)有CEC［5］、vWF［6］及TM［7］，均能反映VEC的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)VEC的功能因?yàn)閾p傷而發(fā)生改變時(shí)，作為構(gòu)成細(xì)胞的基本物質(zhì)DNA也存在損傷，單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（SCGE）被廣泛應(yīng)用于DNA損傷的檢測。在一定條件下，DNA遷移距離（彗星尾長）和DNA含量（熒光強(qiáng)度）分布與DNA損傷程度呈線性相關(guān)，因此，尾矩（尾部DNA的含量與尾長的乘積）被作為SCGE定量分析的主要依據(jù)［8］。本研究表明，CHF患者血清作用于體外培養(yǎng)的VEC導(dǎo)致細(xì)胞的損傷，表現(xiàn)為模型組細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞損傷標(biāo)志物水平上升，并且VEC細(xì)胞DNA損傷明顯。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致［9，10］。CHF損傷后的VEC經(jīng)不同劑量的TanⅡA干預(yù)后，其損傷得到修復(fù)，具體表現(xiàn)為VEC損傷標(biāo)志物水平的下降、細(xì)胞DNA損傷指標(biāo)的降低及細(xì)胞活性提高，并且呈一定的劑量依賴關(guān)系。表明TanⅡA對CHF患者VEC損傷具有保護(hù)作用。

TanⅡA 是“活血化瘀”中藥丹參的脂溶性有效單體，具有抗缺血、缺氧，改善微循環(huán)，抗血栓形成等作用。TanⅡA 在臨床上治療 CHF 取得較好的療效，能夠改善患者的心功能［11］，增加CHF患者的心輸出量，其機(jī)制可能與TanⅡA降低血漿vWF和升高6-酮-前列腺素F1α的水平，改善血管內(nèi)皮功能的作用有關(guān)［12］。以往研究TanⅡA保護(hù)CHF患者VEC的機(jī)制主要是集中在TanⅡA對其分泌功能的影響上。本研究亦表明，TanⅡA處理后的VEC其損傷標(biāo)志物的CEC、vWF及TM的水平下降，同時(shí)觀察到，當(dāng)VEC因各種因素受到損傷，功能發(fā)生變化時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞DNA同樣存在損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞尾部DNA含量、彗星長及尾矩的增加，而通過TanⅡA干預(yù)之后，上述指標(biāo)有明顯的下降，表明TanⅡA對VEC的DNA損傷有保護(hù)作用，這可能是TanⅡA治療CHF的機(jī)制之一，值得進(jìn)一步研究。

1 顧東風(fēng)，黃廣勇，吳錫桂，等.中國心力衰竭流行病學(xué)調(diào)查及其患病率中國心血管健康多中心合作研究（專題報(bào)告）.中華心血管病雜志，2003， 31（1）：3～6.

2 Yancy CW，Jessup M，Bozkurt B，et al. 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure：a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol，2013，62（16）：e147～239.

3 Hoeschen RJ. Oxadative stress and cardiovascular disease. Can J. Cardiol，2009，13（11）：102.

4 周鵬.前列地爾對老年慢性心力衰竭患者心功能和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的影響.中國老年學(xué)雜志，2013，6（33）：2874～2876.

5 Hunting CB，Noort WA，Zwaginga JJ. CEC reflect the state of endothelium vascular injury，repair and neovascularization. Vox Sang，2005， 88（1）：1～9.

6 VilaM， Martinez-salesV， AlmenarL，et al. Inflammation， endothelial dysfunction and angiogenesis markers in chronic heart failure patients. Int J Cardio， 2008，130（2）：276～277.

7 Salomaa V，Wu KK. Soluble thrombomodul in as predictor of incident coronary heart disease.Lancet，1999，354（9190）：1646～1647.

8 田云，盧向陽，易克，等.單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù).生命的化學(xué)，2004，24（1）：77～78.

9 鄭衛(wèi)星，蓋曉波，南柏松.充血性心力衰竭患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其臨床意義.中國循環(huán)雜志，1995，10（4）：195～197.

10 王矩偉，王錫田，陳春波，等.充血性心力衰竭患者血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2002，1（37）：36～37.

11 倪豐廣.丹參酮ⅡA 治療慢性充血性心力衰竭臨床觀察.中國中醫(yī)急癥，2012，2（4）：618～619.

12 李博，韓碧園，葉貴娣，等.丹參酮ⅡA對慢性心力衰竭患者心功能的作用及機(jī)制.山東醫(yī)藥，2010，50（33）：36～38.

Objective To study the effect of tanshinoneⅡA（TanⅡA）on the vascular endothelial cell（VEC）injury induced by the serum of the patients with chronic heart failure（CHF），and to explore the mechanism of action further. Methods The human umbilicus vein endothelial cells（CRL-1730）were injured by the 15% serum of the patients with CHF，then treated with different concentrations of TanⅡA（10μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml）for 24hours.The activity and the DNA damage of the VEC were determined.The level of the circulating endothelial cells（CEC），von willebrand factor（vWF）and thrombomodulin（TM）in the supernatant were also determined. Results Compare to the healthy control group，the activity of the VEC in the model group was decreasesd（P＜0. 05），the percentage of tail DNA，tail extent and the olive tail moment were increased（P＜0.05），the level of the CEC，VWF and TM were increased（P＜0.05）. Compare to the model group，20 μg / ml and 40 μg / ml TanⅡA can increase the activity of the VEC（P＜0.05），reduce the cell DNA damage（P＜0.05），all the three dose of TanⅡA can decrease the level of CEC，and 20 μg / ml and 40 μg / ml TanⅡA can decrease the level of vWF（P＜0.05），and only the 40μg/ml TanⅡA can decrease the level of TM（P＜0.05）. Conclusion TanⅡA has a protective effect on the VEC by reducing the damage of the cell DNA maybe one of the mechanism in treating CHF.

TanshinoneⅡA Chronic heart failure Vascular endothelial cell DNA damage

廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目（201308196）

528200 廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（彭環(huán)慶 彭志允 謝維寧 范志勇 唐鐘祥 林輝文 李烽輝 王穎菁 黃振）528000 廣東省佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院（張志堅(jiān)）