陳 漾， 李攻科， 胡玉玲

(中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州 510257)

農(nóng)藥可有效防治病蟲害，因此在農(nóng)林生產(chǎn)中被廣泛使用。但隨著農(nóng)藥的大量以及不合理的使用，也造成了果蔬中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的普遍現(xiàn)象，嚴(yán)重影響和威脅人類的健康和生命安全。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確分析食品中農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)已成為研究的熱點(diǎn)。食品中農(nóng)藥殘留分析檢測方法常用的主要有氣相色譜法(GC)[1 - 3]、高效液相色譜法(HPLC)[4 - 6]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7 - 17]、酶抑制法[18 - 20]、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)[21 - 23]等。但這些方法普遍存在操作繁瑣、樣品前處理復(fù)雜、分析時(shí)間長、有機(jī)溶劑或化學(xué)藥品消耗量大、儀器設(shè)備昂貴，不利于現(xiàn)場快速檢測等缺點(diǎn)。

表面增強(qiáng)拉曼光譜法(Surface-enhance Raman Spectroscopy，SERS)是一種新型光譜檢測技術(shù)，它具有檢測靈敏度高、樣品前處理簡單、分析速度快、儀器體積小巧便于攜帶、檢測成本低、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)原位檢測等優(yōu)點(diǎn)，在食品分析檢測方面顯示出巨大的潛力。SERS技術(shù)用于實(shí)際的食品分析還處于起步階段[24 - 26]。本文基于SERS技術(shù)，建立了飲用水、碳酸果汁飲料和水果皮中福美雙、二氰蒽醌和滅蠅胺的快速定量檢測的分析方法。該方法樣品前處理簡單、分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度和精密度較好，有望應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的快速分析檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DeltaNu Inspector拉曼光譜儀(美國，DeltaNu公司)；TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湘儀儀器有限公司)；SQP電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；SB-5200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；10 mL一次性使用無菌注射器(帶針頭)(浙江歐健醫(yī)用器材有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取0.0100 g的福美雙、二氰蒽醌和滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品(98%，百靈威科技有限公司)，并分別以無水乙醇、丙酮和甲醇稀釋，配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。系列濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液用儲備液分別以超純水稀釋配制，密封，于4 ℃避光保存。Au@SiO2納米粒子溶液：濃度為2.94×10-4mol/L，Au納米粒子半徑約為55 nm，SiO2外殼為1～2 nm，帶針孔(廈門大學(xué))。Au納米粒子：參考Frens法[27]制備而略有改動(dòng)，將200 mL超純水與1.00 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯金酸溶液混合均勻后，在140 ℃油浴鍋中加熱至沸，保持沸騰約5 min后，快速一次性加入1.48 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉溶液作為還原劑，再連續(xù)加熱反應(yīng)40 min，冷卻至室溫后，密封保存于暗處，制成的金納米粒子直徑約55 nm。KAuCl4·2H2O(含金為48%～50%，阿拉丁試劑公司)；檸檬酸三鈉(分析純，沈陽市試劑三廠)；王水(自配)；濃H2SO4與30%H2O2混合溶液(3∶1,V/V)；丙酮、無水甲醇和無水乙醇均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

各類碳酸果汁飲料和水果均購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 樣品處理

1.2.1加標(biāo)飲用水和各類加標(biāo)碳酸果汁樣品的制備將各類碳酸果汁飲料經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后作為底液，用1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配制成系列濃度的加標(biāo)分析樣品。加標(biāo)飲用水無需前處理，直接用1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配制成系列濃度的加標(biāo)分析樣品。

1.2.2果皮樣品的制備果皮洗凈晾干并用干凈的剪刀剪成約6×6 mm大小，并用移液槍移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接噴灑于果皮表面，自然揮干溶劑后，待測。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1系列濃度農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液和加標(biāo)樣品的SERS檢測采用濃縮一定倍數(shù)的Au@SiO2增強(qiáng)粒子，將待測液與Au@SiO2粒子以一定的體積比置于光滑硅片表面(硅片事先浸泡在體積比為3∶1濃H2SO4與30%H2O2的混合溶液中，使其表面羥基化)混合均勻，調(diào)焦后獲得譜圖。激光光源波長為785 nm，激光時(shí)間為1 s；激光次數(shù)為3；每次測試扣除暗電流1 s；測試模式為Software；結(jié)果為 Average；激光功率為High；分辨率為Low。

1.3.2果皮表面農(nóng)藥的SERS檢測將處理后的果皮樣品滴加20 μL乙醇完全覆蓋于果皮表面，再加入一定體積濃縮一定倍數(shù)的 Au@SiO2增強(qiáng)粒子，或Au納米粒子充分混勻后調(diào)焦得到譜圖。激光功率為60 mW；激光光源波長為785 nm，激光時(shí)間3 s；激光次數(shù)3；每次測試扣除暗電流1 s；測試模式為Software；結(jié)果為 Average；分辨率為Low。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化與性能

采用單因素優(yōu)化法，對增強(qiáng)粒子的濃縮倍數(shù)和待測液與增強(qiáng)粒子的體積比進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1福美雙的分析條件及性能檢測福美雙的最優(yōu)條件為Au@SiO2納米增強(qiáng)粒子濃縮50倍，待測液與Au@SiO2體積比為4∶1。福美雙以1 373 cm-1作為定量峰，其特征峰峰面積在0.03～0.20 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，曲線方程為：y=200595.6x+16727.9，相關(guān)系數(shù)r2=0.9982，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.7%～6.5%(n=5)之間。選擇2.0 μg/L(稍高于空白的濃度)福美雙標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)上述方法分別測定20次，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差乘以測試濃度再除以峰面積的平均值進(jìn)行計(jì)算，得到檢出限為1.4 μg/L。

2.1.2二氰蒽醌的分析條件及性能檢測二氰蒽醌的最優(yōu)條件為Au@SiO2納米增強(qiáng)粒子濃縮40倍，待測液與Au@SiO2體積比為3∶1。二氰蒽醌以1 476 cm-1為定量峰，其特征峰峰面積在0.2～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系佳，曲線方程為：y=478246.6x+174823.2，相關(guān)系數(shù)r2=0.9960，RSD為1.7%～4.9%(n=5)，檢出限達(dá)0.020 mg/L。

2.1.3滅蠅胺的分析條件及性能檢測滅蠅胺的最優(yōu)條件為Au納米粒子濃縮40倍，待測液與Au納米粒子體積比為1∶1。滅蠅胺以1 078 cm-1為定量峰，曲線方程為：y=5674.6x+30662，線性范圍為0.5～20 mg/L，相關(guān)系數(shù)r2=0.9801，RSD在1.2%～12.2%之間(n=5)，檢出限為0.030 mg/L。

2.2 樣品測定

2.2.1樣品中福美雙的檢測生活飲用水和碳酸雪梨飲料中均沒有檢測到福美雙，采用加標(biāo)回收試驗(yàn)對方法進(jìn)行評價(jià)。樣品無需前處理，直接取1.0 mL實(shí)際樣品，用1.0 g/L福美雙儲備液添加濃度為0.080 mg/L和0.10 mg/L的加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測。在加標(biāo)樣品中，福美雙的特征峰仍然清晰可辨，沒有發(fā)生明顯的位移，與標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS譜圖出峰位置一致，無其他雜峰出現(xiàn)，說明該方法選擇性和專一性好(圖1曲線a、b、c)。加標(biāo)回收率在105.0%～107.8%之間，平行樣間定量峰峰面積RSD均小于6.2%(表1)，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較好，適合于分析檢測生活飲用水和碳酸雪梨飲料中福美雙的殘留量。

表1 生活飲用水和碳酸雪梨汁中福美雙的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

aAverage of five determinations±standard deviation.

為了拓展SERS的應(yīng)用，使用10 μL 濃縮40倍的Au@SiO2增強(qiáng)粒子對果皮表面噴灑的目標(biāo)分子進(jìn)行分析檢測，結(jié)果如圖1(d、e)和表3所示。柑皮和檸檬皮表面福美雙均以1 383 cm-1為定量峰，線性范圍分別在5.6～28 ng/cm2和11～33 ng/cm2，相關(guān)系數(shù)均大于0.98，各濃度的平行樣之間的RSD均小于5.0% ，說明該方法精密度較好，有望應(yīng)用于果皮表面福美雙殘留量的定量分析。

2.2.2樣品中二氰蒽醌的分析檢測生活飲用水中均沒有檢測到二氰蒽醌，方法評價(jià)采用加標(biāo)回收試驗(yàn)。樣品無需前處理，各取1.0 mL日常飲用水，用1.0 g/L二氰蒽醌丙酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配制成濃度為0.50，1.0 mg/L的加標(biāo)樣，結(jié)果如圖2(b、c)和表2所示。樣品中二氰蒽醌的特征定量峰1 476 cm-1峰形明顯，沒有發(fā)生位移，基質(zhì)干擾小，加標(biāo)回收率在80.4%～98.8%之間，各濃度5個(gè)平行樣的定量峰峰面積RSD均小于8.0%，表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度較好，適合于分析檢測日常飲用水中二氰蒽醌的殘留量。

圖1 加標(biāo)飲用水、碳酸雪梨飲料和果皮表面福美雙的SERS譜圖

圖2 加標(biāo)飲用水、碳酸果飲和果皮表面二氰蒽醌的SERS譜圖

在碳酸果汁飲料的檢測中，由于基體復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，對二氰蒽醌的SERS檢測產(chǎn)生很大的干擾和影響，故采用空白基質(zhì)溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液作定量校正，去除基質(zhì)效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量，如圖2(d～i)和表3所示。結(jié)果表明，在加標(biāo)的各種果汁基質(zhì)中，二氰蒽醌在一定濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.98，RSD小于9.5%。

表2 生活飲用水中二氰蒽醌的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

aAverage of five determinations±standard deviation.

此外，使用15 μL濃縮30倍的Au@SiO2增強(qiáng)粒子對果皮表面噴灑的目標(biāo)物進(jìn)行分析檢測，結(jié)果如圖2(j、k)和表3所示。橙皮和檸檬皮表面二氰蒽醌的定量峰峰面積均在27.8～556 pg/cm2濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.9917和0.9971，各濃度的平行樣之間的RSD均小于9.5% ，說明該方法精密度較好，有望應(yīng)用于果皮表面二氰蒽醌殘留量的定量分析。

圖3 各碳酸果飲中和果皮表面滅蠅胺的SERS譜圖

2.2.3滅蠅胺的分析檢測由于滅蠅胺在實(shí)際樣品的測定中受基質(zhì)干擾較大，故使用空白基質(zhì)溶液將1.0 g/L滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度進(jìn)行SERS檢測，標(biāo)準(zhǔn)加入法定量分析，如圖3(b～d)和表3所示。碳酸雪梨汁、檸檬汁和橙汁飲料中，滅蠅胺定量峰峰面積與濃度呈現(xiàn)良好線性，相關(guān)系數(shù)均在0.98以上，RSD小于11.0%。

使用10 μL(柑皮)或15 μL(檸檬皮)濃度40倍的Au納米增強(qiáng)粒子對噴灑不同濃度滅蠅胺的果皮表面進(jìn)行SERS檢測，柑皮和檸檬皮分別以1 090和1 080 cm-1為定量峰，結(jié)果如圖3(e、f)和表3所示。柑皮和檸檬皮表面滅蠅胺的定量峰峰面積分別在0.28～5.6 ng/cm2和0.17～2.8 ng/cm2濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)0.9772和0.9850，各濃度的平行樣之間的RSD均小于11.0%， 該方法有望應(yīng)用于果皮表面滅蠅胺殘留量的定量分析。

表3 加標(biāo)碳酸果飲中和果皮表面福美雙、二氰蒽醌和滅蠅胺的定量分析線性方程及檢出限

(續(xù)表3)

aThe number of the parallel samples is five for carbonated fruit juice and three for fruit peels;bThe unit of measure here is ng/cm2.cThe unit of measure here is pg/cm2.

對比福美雙、二氰蒽醌和滅蠅胺在標(biāo)準(zhǔn)溶液和碳酸果汁飲料中的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，碳酸果汁飲料中目標(biāo)物的檢出限均高于標(biāo)準(zhǔn)溶液中的檢出限，且線性范圍變窄，原因可能為碳酸飲品中存在的非目標(biāo)物質(zhì)分子在一定程度上占據(jù)了SERS活性位點(diǎn)，造成目標(biāo)分子與納米增強(qiáng)粒子在物理吸附上發(fā)生困難，此外，這些非目標(biāo)分子很可能會產(chǎn)生一定的拉曼散射信號[28]，并與目標(biāo)分子的譜圖發(fā)生相互作用，從而影響線性結(jié)果及SERS檢測靈敏度。此外，相對于標(biāo)準(zhǔn)水溶液系列，飲料與果皮等實(shí)際樣品中目標(biāo)分子的定量峰有時(shí)會發(fā)生一定的偏移(±14 cm-1以內(nèi))，說明基質(zhì)中的其他物質(zhì)成分可能與吸附在納米增強(qiáng)粒子表面的目標(biāo)分子發(fā)生作用，改變了目標(biāo)分子與增強(qiáng)粒子的相互作用和吸附位點(diǎn)，導(dǎo)致了相關(guān)官能團(tuán)的吸收譜帶發(fā)生位移[29]，但并不影響對目標(biāo)分子的識別與鑒定。

3 結(jié)論

建立了基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的生活飲用水、碳酸果汁飲料和果皮表面殘留的福美雙、二氰蒽醌和滅蠅胺3種農(nóng)藥的快速定量分析方法，檢出限分別為1.4 μg/L、0.02 mg/L和0.03 mg/L，低于國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2012)中規(guī)定的蔬果中3種農(nóng)藥的最大殘留限量(其中，福美雙：5 mg/kg；二氰蒽醌：2 mg/kg；滅蠅胺：0.5 mg/kg)。福美雙和二氰蒽醌在實(shí)際樣品中的加標(biāo)回收率分別在104.5%～107.1%和81.1%～100.0%之間，RSD均小于8.0%。還成功測定了碳酸果汁飲料中和果皮表面的二氰蒽醌和滅蠅胺。顯示了SERS技術(shù)應(yīng)用于食品安全中的農(nóng)藥殘留的定性和定量分析有良好的應(yīng)用前景。