黎雪風(fēng)， 黃 昱， 劉志洪

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)是指熒光供受體在1～10 nm距離內(nèi)，因?yàn)楣w發(fā)射光譜與受體吸收光譜有一定重疊，發(fā)生偶極-偶極作用而使供體激發(fā)態(tài)能量通過非輻射方式傳遞給受體[1]。FRET作為一種均相檢測技術(shù)，它具有操作簡單、分辨率高、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)。但是傳統(tǒng)的下轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(如有機(jī)染料)作為FRET能量供體存在兩大局限：紫外光或可見光激發(fā)下引起的生物樣品本底熒光及散射光對檢測信號存在干擾；較小的Stokes位移導(dǎo)致供受體激發(fā)光譜有一定重疊，造成供受體的同時(shí)激發(fā)，影響靈敏度[2,3]。稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(Up-Conversion Phosphors,UCPs)是一類長波激發(fā)、短波發(fā)射材料，具有Stokes位移大、發(fā)射光譜窄、光穩(wěn)定性好等優(yōu)良的特性[4]，是極有發(fā)展前景的能量供體。目前，UC-FRET技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于復(fù)雜生物基質(zhì)中的蛋白、酶、核酸等目標(biāo)物的檢測[5]。由于目前常用的UCPs粒徑約為幾十納米，而FRET又是一個(gè)高度依賴供受體間距離的過程，這個(gè)特性使得只有UCPs表面及接近表面的發(fā)光中心能被熒光受體猝滅，因此，猝滅效率高的熒光受體對于UC-FRET靈敏度的提高具有重要意義。使用有機(jī)染料做UCPs能量受體，猝滅效率低影響檢測靈敏度[6]，而無機(jī)納米材料因其較高的猝滅效率被引進(jìn)UC-FRET體系中。Wang等[7]用納米金做受體，對UCPs的猝滅效率可以達(dá)到60%，但是納米金做受體時(shí)需要進(jìn)行復(fù)雜的表面標(biāo)記或功能化修飾，過程繁瑣。碳材料由于猝滅效率高、生物無毒及免標(biāo)記等優(yōu)勢也逐漸被用于UC-FRET技術(shù)中。Zhang 等[8]使用氧化石墨烯做熒光受體，對UCPs的猝滅效率可以達(dá)到81%；Wang[9]等利用碳球(Carbon Nanoparticles，CNPs)作為UCPs的能量受體其猝滅效率可達(dá)到80%，但碳材料本身水溶性較差，在一定程度上限制了它們的應(yīng)用。近年來，聚合物材料作為熒光受體也開始用于熒光傳感技術(shù)[10,11]。 Wang等[12]利用聚間苯二胺(Poly-m-phenylenediamine,PMPD)納米球做UCPs受體檢測核酸，PMPD通過π-π堆積作用與標(biāo)記有核酸的UCPs組裝到一起，其猝滅效率達(dá)到90%。相比碳材料，較多氨基和缺電子芳香環(huán)的存在使PMPD具有更好的水溶性和分析性能。

本研究構(gòu)建了以PMPD為能量受體的UC-FRET凝血酶生物傳感器，該傳感器結(jié)合能量供體UCPs背景干擾小，以及能量受體PMPD的良好水溶性，免標(biāo)記及強(qiáng)猝滅效率的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對凝血酶的高靈敏度與高選擇性檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

980 nm半導(dǎo)體近紅外激光器(北京海特光電責(zé)任有限公司)；RF5301型熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司)；JEM-2010型透射電子顯微鏡(日本，電子株式會(huì)社)；D8型X射線衍射儀(德國，Rucker公司)；UV2550型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Legend-Micro-17R高速冷凍離心機(jī)(美國，Thermo-Scientific公司)。

Y2O3、Yb2O3和Er2O3均為光譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)為化學(xué)純(Alfa-Aser)；NaF為化學(xué)純(中國長江化工廠)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)為分析純(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)；4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(sulfo-SMCC，上海生工生物工程有限公司)；凝血酶適配體(Aptamer,5′-SH-GGTTGGTGTGGTTGG -3′)；聚乙烯亞胺(PEI)(分子量25 000，Sigma-Aldrich)；IgG和牛血清白蛋白(BSA)為生化試劑(北京中杉金橋生物科技有限公司)；HNO3、乙醇、(NH4)2S2O8、間苯二胺和NaCl均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用水為高純水。

1.2 PMPD的合成

PMPD的合成參照文獻(xiàn)方法[10]：將1.8 mmol/L(NH4)2S2O8溶液加入到100 mL圓底燒瓶內(nèi)，再向燒瓶中加入30 mL N-甲基吡咯烷酮(NMP)，劇烈攪拌下快速加入0.6 mmol/L間苯二胺水溶液，攪拌反應(yīng)24 h后，離心分離，將所得沉淀分別用乙醇、水洗滌3次，最后分散在水中，定容至1 mg/mL，冷藏備用。

1.3 PEI修飾NaYF4∶Yb，Er的合成

0.25 mmol的Ln2O3(Y/Yb/Er=0.78∶0.2∶0.02，摩爾比)溶解于熱的濃HNO3(65 ℃)，攪拌，待溶液澄清透明時(shí)升溫至135 ℃蒸干水分得到Ln(NO3)3固體，用10 mL水溶解后加入到50 mL的聚四氟乙烯內(nèi)襯中，再加入18 mL含680 mg PEI的乙醇溶液。上述反應(yīng)液在快速攪拌的條件下，逐滴加入8 mL含3 mmol NaF溶液，滴加完后將內(nèi)襯置于高壓反應(yīng)釜中，200 ℃反應(yīng)10 h，自然冷卻至室溫，離心分離，收集沉淀物并用乙醇和水分別洗滌2～3次，定容至4 mL，超聲分散后，冷藏備用。

1.4 UCPs與凝血酶適配體偶聯(lián)

將2 mg的PEI-UCPs溶于2 mL 50 mmol/L的HEPES緩沖溶液(pH=7.2)中，加入0.4 mg sulfo-SMCC,常溫下攪拌1 h，然后離心分離，將沉淀用HEPES緩沖溶液(pH=7.2)洗滌三次，除去多余的sulfo-SMCC有機(jī)小分子，最后分散于2 mL HEPES緩沖溶液(pH=7.2)中，加入20 nmol的凝血酶適配體(Aptamer)常溫下孵育過夜后，離心分離，將沉淀用HEPES緩沖溶液(pH=7.2)洗滌三次后，分散在2 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.2)中。將得到的1 mg/mL UCPs置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 UCPs-PMPD FRET傳感器的構(gòu)建

1.5.1猝滅劑濃度選擇將1 mg/mL UCPs-aptamer用50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.2)稀釋至0.1 mg/mL。在一系列2 mL EP管中加入100 μL UCPs-aptamer，再分別加入不同體積的1 mg/mL PMPD溶液，使PMPD的終濃度依次為0、0.017、0.067、0.1 、0.133、0.167、0.267 mg/mL，所有EP管中反應(yīng)液總體積用50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.2)定容至300 μL，于25 ℃下孵育反應(yīng)1 h，讓熒光得到充分的猝滅。在980 nm激發(fā)波長下測定上述各樣品的上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度，比較熒光強(qiáng)度的變化，得出最佳猝滅劑濃度。為了排除非特異性猝滅，分別測定未偶聯(lián)適配體質(zhì)量濃度0.033 mg/mL的UPCs在加入0.167 mg/mL PMPD前后熒光強(qiáng)度的變化。

1.5.2猝滅時(shí)間的選擇在最佳供受體濃度條件下(UCPs-aptamer 0.033 mg/mL,PMPD 0.167 mg/mL)，分別反應(yīng)0、5、10、20、30、60 min，在相同條件下測量熒光強(qiáng)度。

1.5.3凝血酶定量檢測取100 μL 0.1 mg/mL UCPs-aptamer加入到一系列2 mL EP管中，再加入終濃度依次為0、0.2、0.5、0.8、2、5、10、15、20 nmol/L的凝血酶，并用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.2)定容至250 μL。將該混合液置于37 ℃下反應(yīng)2 h，以便核酸與目標(biāo)物充分反應(yīng)。待反應(yīng)液自然冷卻至室溫，然后加入50 μL 1 mg/mL PMPD，將反應(yīng)液置于25 ℃下孵育反應(yīng)1 h后，測定上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度。

1.6 選擇性

在體系中加入BSA、甘氨酸(Gly)以及葡萄糖等干擾物質(zhì)，過程如下：將100 μL 0.1 mg/mL UCPs-aptamer加入到一系列2 mL EP管中，再分別加入5 nmol/L的凝血酶和干擾物質(zhì)，并用Tris-HCl緩沖液(pH=7.2)定容至250 μL，于37 ℃下反應(yīng)2 h，待其自然冷卻至室溫，再加入50 μL 1 mg/mL PMPD溶液，于25 ℃下孵育反應(yīng)1 h。測定上述樣品的上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

圖1 基于PMPD做受體的UC-FRET生物傳感器檢測凝血酶的示意圖

2.1 基于聚間苯二胺做受體的UC-FRET原理

如圖1所示，將帶有-SH的凝血酶核酸適配體共價(jià)修飾到帶有-NH2的UCPs表面，偶聯(lián)形成UCPs-aptamer復(fù)合物。研究表明，富含π電子的材料可以與單鏈DNA通過π-π堆積作用組裝到一起[13]，當(dāng)體系中加入PMPD后，標(biāo)記有凝血酶適配體的UCPs組裝到PMPD表面，熒光供受體間距離被拉近，發(fā)生FRET，供體熒光被猝滅。當(dāng)體系中加入凝血酶后，由于凝血酶與適配體有更高的親和性，兩者形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)[14]， UCPs-aptamer脫離受體表面，供受體間距離增大，F(xiàn)RET消失，供體熒光得到恢復(fù)。同時(shí)，熒光恢復(fù)程度與凝血酶的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比關(guān)系，從而可實(shí)現(xiàn)定量檢測。

2.2 UCPs與PMPD的表征

由X射線衍射(XRD)(圖2A)可以看出，采用一步水熱法合成的PEI-UCPs是以六方相為主，并含少許立方相的混合晶相。由透射電鏡(TEM)(圖2B)表征結(jié)果可知，UCPs尺寸均一，粒徑大約為30～40 nm，其形貌接近球形。圖2C是PMPD的掃描電鏡(SEM)圖，結(jié)果表明所合成的PMPD為粒徑分布在30～60 nm的均一球形納米顆粒。

圖2 (A)PEI-UCPs的X射線衍射(XRD)圖(立方相，?六方相)；(B)PEI-UCPs透射電鏡(TEM)圖；(C) PMPD的掃描電鏡(SEM)圖

圖3 (A) PMPD的紫外-可見吸收光譜(a) 和UCPs的熒光發(fā)射光譜(b)；(B)UCPs標(biāo)記適配體前后的紫外-可見吸收光譜

PMPD的紫外-可見吸收光譜如圖3(A)，PMPD在波長200～700 nm范圍有明顯的吸收，與UCPs在500～600 nm上轉(zhuǎn)換發(fā)光有較好重疊，為后面FRET過程的發(fā)生提供了理論依據(jù)。UCPs標(biāo)記凝血酶適配體前后紫外-可見吸收光譜如圖3(B)所示，UCPs-aptamer在260 nm附近有明顯的DNA吸收峰，表明核酸已成功標(biāo)記在UCPs上。

2.3 PMPD對UCPs的熒光猝滅

在等量的UCPs-aptamer中加入不同量的PMPD，隨著PMPD含量的增加，上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度逐漸減小。如圖4A，當(dāng)PMPD在體系中濃度為0.167 mg/mL時(shí)，熒光猝滅效率達(dá)到最大，約為70%，且隨著PMPD濃度的增大變化逐漸減小，最終達(dá)到平臺。為驗(yàn)證上轉(zhuǎn)換熒光的猝滅是由FRET引起的，對比了同濃度但是不進(jìn)行適配體標(biāo)記的UCPs，觀察在UCPs中加入0.167 mg/mL PMPD后熒光變化(圖4B)，可以看出未標(biāo)記的UCPs僅10%的熒光被PMPD猝滅，相較標(biāo)記后70%的熒光猝滅可知UCPs與PMPD的非特異性猝滅較小，熒光猝滅主要由PMPD與適配體之間的π-π堆積作用發(fā)生FRET引起。同時(shí)，通過考察反應(yīng)時(shí)間對熒光猝滅效率的影響(圖4C)可知，在供體UCPs-aptamer體系中加入0.167 mg/mL PMPD后，供體的熒光隨著時(shí)間的延長而逐漸猝滅，在約30 min后即可達(dá)到猝滅平臺。為了獲得穩(wěn)定的猝滅效率和熒光信號，在此后的回升實(shí)驗(yàn)中，統(tǒng)一選定熒光猝滅時(shí)間為1 h。

圖4 (A)不同濃度PMPD對熒光的猝滅(0，0.017，0.067，0.133，0.167 mg/mL)；(B) PMPD對UCPs的非特異性猝滅(a.UCPs,b.UCPs-PMPD)；(C)PMPD對UCPs熒光猝滅隨時(shí)間變化圖

2.4 凝血酶的定量檢測

由圖5A可以看出，當(dāng)凝血酶加入到UCPs-aptamer-PMPD體系中時(shí)，由于與適配體DNA形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)，核酸與PMPD之間的π-π堆積作用減弱，從而導(dǎo)致熒光供體UCPs-Aptamer遠(yuǎn)離PMPD表面，F(xiàn)RET消失，供體的熒光得到恢復(fù)，且隨著目標(biāo)物凝血酶濃度的不斷增大，供體的熒光恢復(fù)程度增大。圖5B顯示相對熒光強(qiáng)度((F-F0)/F0(其中F0代表沒有凝血酶存在時(shí)供體的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)代表加入不同濃度凝血酶后供體的熒光強(qiáng)度)逐漸增大，且在凝血酶濃度0.2～5.0 nmol/L濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(圖5B)，線性相關(guān)系數(shù)R=0.995，對目標(biāo)凝血酶的檢測限(3S0/k)為0.18 nmol/L。

圖5 (A)不同濃度凝血酶加入體系后熒光恢復(fù)圖；(B)相對熒光強(qiáng)度與凝血酶濃度的線性關(guān)系圖

圖6 其他物質(zhì)的干擾性考察

2.5 UC-FRET凝血酶適配體傳感器的選擇性

為了驗(yàn)證UC-FRET凝血酶適配體傳感器對凝血酶的選擇性，考察了葡萄糖、氨基酸(Gly)和蛋白質(zhì)(BSA)對傳感器的影響。如圖6所示，在加入的蛋白濃度與凝血酶相同的情況下，只有加入凝血酶后供體熒光強(qiáng)度才得到明顯的恢復(fù)，而干擾物質(zhì)對傳感器的熒光沒有明顯影響，與空白值接近，證明該傳感器對凝血酶具有很好的選擇性。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了基于UC-FRET的凝血酶生物傳感器。當(dāng)PMPD濃度為0.167 mg/mL時(shí)，熒光猝滅效率可以達(dá)到70%，在體系中加入目標(biāo)物凝血酶后，熒光恢復(fù)程度與凝血酶濃度在0.2～5.0 nmol/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，檢出限為0.18 nmol/L。良好的猝滅效率，水溶性及免標(biāo)記的特性使得PMPD成為FRET技術(shù)中極具競爭性的受體。