王 芳 ，謝關(guān)林 ，鄒珍友 ，湯佳美 ，蔡 靜 ，倪夢(mèng)潔 ，黃 潔

（1.新縣茶產(chǎn)業(yè)辦公室，河南 信陽 465500；2.浙江大學(xué) 植物保護(hù)系 農(nóng)業(yè)部病蟲分子生物學(xué)開放重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310029；3.臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，浙江 臺(tái)州 318000）

0 引言

2006年上半年在浙江杭州地區(qū)發(fā)現(xiàn)一嚴(yán)重的桑樹細(xì)菌性“枯萎”病害，幼齡桑發(fā)病初期由枝條上葉片開始呈失水狀，繼而全株葉片凋萎、枯焦，直至脫落；剝開主干皮層，可見木質(zhì)部褐色條狀斑；病株根部外觀正常，但木質(zhì)部嚴(yán)重變褐，在夏伐整枝后出現(xiàn)大批枯死現(xiàn)象。從桑園的發(fā)病情況與病株的癥狀看，與桑青枯菌（Ralstonia solanacearum）較為相似。但最大的不同之處是該病一般始于桑樹下部葉片，幼桑上尤為明顯，病葉“枯萎”后由下而上脫落，造成光桿。經(jīng)細(xì)菌學(xué)、電鏡觀察、致病性及Kock氏假說測(cè)定、Biolog鑒定、脂肪酸分析、生理生化、ERIC-PCR分析、16S rRNA序列分析及與腸桿菌屬（Enterobacter）中與植物有關(guān)的7個(gè)模式種菌株和其他3株參考菌株的比較，確認(rèn)桑“枯萎”病為腸桿菌屬中新種所引起［1-2］。文獻(xiàn)［3］將這一病原新種命名為Enterobacter mori。在桑樹細(xì)菌病害中由Ralstonia solanacearum引起的桑青枯病是國內(nèi)外研究較多的［4-7］，對(duì)病原的檢測(cè)已有較成熟的分子檢測(cè)方法［8］，但到目前為止，由Enterobacter mori引起的桑細(xì)菌性枯萎病菌國內(nèi)外尚無分子檢測(cè)的報(bào)道。

雖然桑青枯與桑枯萎同屬細(xì)菌，癥狀又很相似，但青枯菌分子方法無法檢測(cè)到?？菸?。本研究的目的是建立一種新的PCR檢測(cè)方法，直接用于田間樣品的E.mori菌檢測(cè)，即采用組織浸出液的方式來對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，無需進(jìn)行病原菌的分離和DNA提取即能快速地檢測(cè)到枯萎菌，以阻止該病菌的進(jìn)一步蔓延。

1 材料與方法

1.1 桑細(xì)菌性枯萎菌的分離

從桑樹種植大省浙江和廣西染病的桑樹上分離到96株桑枯萎菌株［2］，從這96株?？菸曛羞x取其中的4個(gè)作為代表菌株用于進(jìn)一步的研究。以本實(shí)驗(yàn)室保存的青枯菌syringae pv.mori（桑疫病菌）、腸桿菌屬的9個(gè)模式菌株和其他7個(gè)病原菌作為桑樹枯萎菌的PCR檢測(cè)對(duì)照。

1.2 DNA的提取

挑取單菌落接種到NA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)。用細(xì)菌全基因組抽提試劑盒進(jìn)行DNA的提取。DNA濃度控制在。85μg/mL～95μg/mL。

1.3 菌懸液的制備

挑取NA平板上的單菌落于1mL蒸餾水中，制成1×109cfu/mL的菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后，制成1×109cfu/mL～1×100cfu/mL各個(gè)濃度梯度的菌懸液，待用。

1.4 測(cè)序及引物的設(shè)計(jì)

通過測(cè)定E.mori的部分ropB基因片段及其相近種和只存在于E.mori中的特定區(qū)間的基因序列，然后根據(jù)RNA聚合酶的ropB基因設(shè)計(jì)能用于E.mori檢測(cè)的特異性引物。

PCR 反應(yīng)采用的體系為:1μL 模板，5μL10×PCR Buffer，0.25μLTaq 酶，20 mM dNTP 0.25μL，0.2μM CM7和 CM31b引 物［9］。 引 物 序 列 為 :CM7:AACCAGTTCCGCGTTGGCCTGG；CM31b:CCTGAACAACACGCTCGGA。

反應(yīng)程序?yàn)?95℃變性 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5min。PCR 產(chǎn)物由中國BGI公司測(cè)序。用ClustalW［10］和Genbank中的一些序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)特異性區(qū)間:Em-ropBF:GCCAAGCCGATTTCTGGAGCA

Em-ropBR:CGTTTCGATTGGACATACG

因此，我們將這對(duì)區(qū)間作為檢測(cè)E.mori的引物。

用PCR和real-time PCR分析E.mori檢測(cè)的條件，即通過設(shè)置退火溫度梯度來確定PCR檢測(cè)E.mori的合適反應(yīng)條件。

1.5 引物的特異性及檢測(cè)靈敏度分析

通過擴(kuò)增表1中所列的菌株分析引物的特異性。分別用梯度稀釋的E.mori DNA和梯度稀釋的菌懸液作為PCR模板測(cè)試引物的靈敏度。

1.6 桑樹疑似枯萎病樣品的檢測(cè)

1.6.1 桑樹樣本材料的制備

采集浙江省杭州市臨安、桐廬和淳安的桑樹枯萎病疑似病株，剪取發(fā)病植株根和莖，用75%乙醇消毒30s，然后用無菌水沖洗3次，剪碎置于1.5mL eppendorf管中，注入約l mL無菌水，120r/min，室溫培養(yǎng)30min。浸液2000r/min離心10min，然后轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中并8000r/min離心20min，小的片段重懸于30μL無菌水中，即為樣品浸出液，可直接作為PCR模板用于進(jìn)一步的分析。

1.6.2 桑樹樣本的檢測(cè)

以浸出液為模板，并以Em-ropBF和Em-ropBR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)采用的體系為:2μL 模板，2.5μL 10×PCR Buffer，0.15μL Taq 酶，20 mM dNTP 0.15μL，0.2μM Em-ropBF 和 Em-ropBR引物，反應(yīng)程序?yàn)?95℃變性 5min；95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5min。

2 結(jié)果

2.1 PCR分析的特異性和靈敏度

檢測(cè)結(jié)果表明，96株桑細(xì)菌性枯萎病菌株以Em-ropBF和Em-ropBR為引物均可以擴(kuò)增出307bp的片段，其他菌株均不能擴(kuò)增出條帶，結(jié)果見表1。

由普通PCR法和RT-PCR來確定這對(duì)引物的靈敏度［11］。并驗(yàn)證了這對(duì)引物具有較高的靈敏度。當(dāng)DNA濃度在10pg/μL或者菌懸液濃度在104-5cfu/mL時(shí)，即可以通過常規(guī)PCR的方法檢測(cè)到病原菌。

表1 桑細(xì)菌性枯萎病病原與其他相近菌株的PCR測(cè)定結(jié)果Table.1 The PCR results of E.mori and other related pathogenic bacteria

2.2 桑細(xì)菌性枯萎病實(shí)際樣本的檢測(cè)

用Em-ropBF和Em-ropBR引物對(duì)采集自杭州地區(qū)桐廬、臨安和淳安的44份桑樹疑似病害樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCR擴(kuò)增結(jié)果如表2，淳安樣品中只有樣品35檢測(cè)到了E.mori，在此只列出了了臨安，桐廬樣品的電泳圖，見圖1。桑細(xì)菌性枯萎病菌E.moris主要存在于桐廬的11份樣本和臨安的7份樣本中，一些萎蔫樣本未檢測(cè)到病原細(xì)菌，同時(shí)經(jīng)鏡檢后也沒有發(fā)現(xiàn)噴菌現(xiàn)象，可能是由非生物因子引起。

圖1 部分杭州臨安、桐廬桑樹樣品中E.mori的檢測(cè)電泳圖Fig.1 DNA biding patterns after specific amplification of ropB regions

表2 浙江杭州地區(qū)桑樹枯萎病疑似病害樣品檢測(cè)結(jié)果Table.2 Detection results of the MWD samples from Hangzhou region

3 討論

3.1 引物的設(shè)計(jì)

ropB基因是編碼RNA聚合酶Beta亞單位的一個(gè)基因，廣泛存在于細(xì)菌當(dāng)中［12］，這個(gè)基因多被應(yīng)用于腸桿菌的分類當(dāng)中［13］。盡管所有細(xì)菌中都存在這個(gè)基因，但是我們?nèi)匀豢梢愿鶕?jù)這個(gè)基因的保守序列來設(shè)計(jì)特異性引物。我們根據(jù)ropB基因序列和E.mori代表菌株系列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)特異區(qū)間，Em-ropBF和Em-ropBR，即檢測(cè)E.mori的特異性引物。

我們選取了一系列的菌株驗(yàn)證了這對(duì)引物的特異性，從浙江和廣西染病的桑樹上分離到的96株?？菸?，以青枯菌、桑疫病菌、腸桿菌屬的9個(gè)模式菌株及本實(shí)驗(yàn)室的其他7個(gè)病原菌為對(duì)照，分離到的枯萎菌在307bp處出現(xiàn)一明顯條帶，其他菌均沒有條帶出現(xiàn)，證明這對(duì)引物具有較高的特異性。近年來，各種Real-time PCR方法被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)中，具有很好的效果［14］，本研究用Real-time PCR的方法驗(yàn)證了這對(duì)引物具有較高的靈敏度。

3.2 對(duì)田間桑樹枯萎病疑似病害樣品的檢測(cè)

在本研究中，我們用一種快速而有效地方法用于田間樣品檢測(cè)。以前的報(bào)道中對(duì)樣品的檢測(cè)主要集中在用一些方法提取DNA后進(jìn)行檢測(cè)，如PVP法［15-16］。提取DNA后，樣品的純度更高，所以可能會(huì)提高PCR檢測(cè)的靈敏度。但是這里我們直接采用浸出液作為PCR模板，無需進(jìn)行病原菌的分離和DNA提取就能直接進(jìn)行樣品檢測(cè)。在對(duì)?？菸姆治鰴z測(cè)中，對(duì)采自杭州地區(qū)桐廬、臨安和淳安的樣品莖和根均做組織浸出液并以枯萎菌引物對(duì)組織浸出液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。對(duì)臨安、桐廬和淳安的樣品鑒定顯示，較多樣品在307bp處出現(xiàn)明顯的條帶。在同一樣品的檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)，其浸出液的菌量分布不均勻，在進(jìn)樣時(shí)必須特別注意。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，同一株發(fā)病較輕的桑樹，其莖桿上無法檢測(cè)到病原菌，但根部往往容易檢測(cè)到，這表明桑枯萎菌主要存在于根部。

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