樂 薇，佘雨珊，吳士筠

（武漢工商學院環(huán)境與生物工程學院，湖北 武漢430065）

我國箬葉資源豐富但利用率低，目前主要用作食品包裝。黃酮類化合物是植物重要的次級代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌等多種生理功能[1－3］。研究表明，總黃酮是箬葉中的重要活性成分，但目前的研究多限于黃酮的提取與測定[4－7］。

作者通過抑菌圈直徑及最低抑菌濃度的測定，分別考察乙醇浸漬法、熱回流法、微波法、超聲波法提取的箬葉總黃酮的抑菌效果，選擇提取箬葉總黃酮的最優(yōu)方法，以期為提高箬葉的附加值和箬葉總黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

箬葉，采于湖北恩施武陵山區(qū)。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、青霉菌（Penicillium）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、白色念珠菌（Moniliaalbican），武漢工商學院生物實驗室提供。

蘆丁標準品、氨芐青霉素，中國藥品生物制品檢定所。

DHP－9272型恒溫培養(yǎng)箱、HZQ－F160型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)生化儀器有限公司；YXQ－LS－SⅡ型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；KQ－100E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；M700型美的微波爐，廣東美的微波爐制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 箬葉總黃酮的提取及純化

取適量箬葉清洗干凈，50℃烘干后粉碎，過18目篩，密封保存。按前期實驗獲得的優(yōu)化條件（表1 ），分別采用乙醇浸漬法、熱回流法、超聲波法及微波法提取箬葉總黃酮，測定提取液中總黃酮含量并計算提取率。提取液減壓濃縮蒸去乙醇，并經(jīng)AB－8型大孔樹脂吸附飽和，用75%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮成浸膏，用適量75%乙醇溶解，使各種提取法所得總黃酮的濃度盡可能一致，即得箬葉總黃酮樣品液。

表1 4種提取方法的優(yōu)化條件Tab.1 Optimum conditions of four kinds of extraction method

1.2.2 箬葉總黃酮提取率的測定

準確稱取蘆丁標準品15mg溶于30%乙醇，定容至100mL。用移液管分別取一定量的蘆丁標準溶液于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，混勻，靜置6min后加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，靜置6min后加入4mL 4%氫氧化鈉溶液，以30%乙醇定容，搖勻，靜置10min后在510nm波長處測定吸光度，參比為不加蘆丁標準品的溶液。以吸光度（A）為縱坐標、蘆丁標準溶液濃度（c）為橫坐標繪制標準曲線，擬合得到線性回歸方程為A＝0.0105c＋0.0017，R2＝0.9998。

以箬葉總黃酮提取液代替蘆丁標準溶液同法測定總黃酮濃度，箬葉總黃酮提取率按下式計算：

式中：c為總黃酮濃度，μg·mL－1；m為箬葉粉末質(zhì)量，g；V為溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 箬葉總黃酮的抑菌實驗

1）抑菌圈的測定

將供試菌種分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面上，細菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）于37℃培養(yǎng)24h進行活化，真菌（白色念珠菌、釀酒酵母菌、青霉菌）于28℃培養(yǎng)24h進行活化。從活化后的斜面上挑取菌體于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。分別吸取各對數(shù)生長期菌液500μL至一定量的無菌水中，配制濃度為1×106CFU·mL－1的菌懸液，搖瓶培養(yǎng)48h，備用。

將約15mL的固體培養(yǎng)基倒入平板（直徑9cm）中，水平放置，待其凝固后用移液器取0.5mL菌懸液注入平板，并用三角棒涂布均勻，每種菌設(shè)置3個重復平板。取滅菌濾紙片（直徑6mm）放入上述各總黃酮樣品液中浸泡24h，取出貼在含菌平板上，用75%乙醇和氨芐青霉素作對照，每皿貼3片。細菌置（37±1）℃培養(yǎng)18～24h、真菌置28℃培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。測定濾紙片的抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

2）最低抑菌濃度的測定

采用連續(xù)稀釋法測定最低抑菌濃度。在無菌條件下，量取一定量箬葉總黃酮提取液，倒入已滅菌的空試管中，再加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中箬葉總黃酮提取液的質(zhì)量濃度（mg·mL－1）分別為2、4、9、20、40，混合均勻，分別接入100μL的菌液后在相應(yīng)條件下培養(yǎng)一段時間，觀察菌體生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法對箬葉總黃酮提取率的影響（表2 ）

表2 提取方法對箬葉總黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of extraction methods on extraction rate of total flavonoids from indocolamus leaves

由表2 可知，熱回流法和超聲波法的總黃酮提取率相當，乙醇浸漬法的提取率略低，微波法的提取率最低。

2.2 不同提取方法提取的箬葉總黃酮的抑菌效果（表3 ）

表3 不同提取方法提取的箬葉總黃酮的抑菌效果（n＝3）Tab.3 Antibacterial effect of total flavonoids from indocalamus leaves extracted by different extraction methods（n＝3）

由表3 可知，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對4種箬葉總黃酮均較為敏感，釀酒酵母菌對4種箬葉總黃酮均不敏感，白色念珠菌和青霉菌對4種箬葉總黃酮部分敏感。其中，大腸桿菌對4種箬葉總黃酮的敏感程度為：乙醇浸漬法＞超聲波法＞熱回流法＞微波法；金黃色葡萄球菌對4種箬葉總黃酮的敏感程度為：超聲波法／熱回流法＞乙醇浸漬法＞微波法。超聲波法提取的箬葉總黃酮對青霉菌有一定的抑制作用，熱回流法提取的箬葉總黃酮對白色念珠菌有一定的抑制作用。表明，箬葉總黃酮對細菌的抑制作用大于對真菌的抑制作用，且提取方法對箬葉總黃酮的抑菌能力有影響。這可能是由于不同的提取方法獲得的黃酮種類有差異，但具體原因還有待進一步研究。

2.3 不同提取方法提取的箬葉總黃酮的最低抑菌濃度（表4）

表4 最低抑菌濃度的測定結(jié)果Tab.4 Determination results of minimal inhibitory concentration

由表4可知，超聲波法提取的箬葉總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和青霉菌的最低抑菌濃度均為39.9mg·mL－1；熱回流法提取的箬葉總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度均為46.2mg·mL－1；乙醇浸漬法提取的箬葉總黃酮對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為22.0mg·mL－1，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為44.0mg·mL－1；微波法提取的箬葉總黃酮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為48.0mg·mL－1。

3 結(jié)論

通過抑菌圈直徑及最低抑菌濃度的測定，分別考察乙醇浸漬法、熱回流法、微波法、超聲波法提取的箬葉總黃酮對細菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）、真菌（白色念珠菌、釀酒酵母菌、青霉菌）的抑菌效果。結(jié)果表明，箬葉總黃酮對細菌的抑制作用大于對真菌的抑制作用，且提取方法對箬葉總黃酮的抑菌能力有影響，不同提取方法提取的箬葉總黃酮抑菌效果為：超聲波法＞熱回流法＞乙醇浸漬法＞微波法。超聲波法比較適合于箬葉總黃酮的提取。

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