彭思佳 丁力 劉清波 陳智勇 肖亮 易自力 蔣建雄

摘要：以荻（Miscanthus sacchariflorus）幼穗和誘導(dǎo)出的愈傷組織為材料探討抗褐化劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸（Vc）、檸檬酸（CA）對(duì)外植體和愈傷組織抗褐化作用，以及愈傷誘導(dǎo)率及愈傷生長(zhǎng)速度的影響。結(jié)果表明，3種抗褐化劑都能抑制外植體和愈傷組織褐化，并提高愈傷組織誘導(dǎo)率。添加0.2 g/L PVP時(shí)荻外植體的褐變程度最低，0.2 g/L CA時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為91.1%，向愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的Vc愈傷組織重量增加倍數(shù)最高，為21.38倍，且愈傷組織褐化率低為25.8%。

關(guān)鍵詞：荻；抗褐化劑；褐化；愈傷生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)：Q 946文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：10095500（2015）05000706

收稿日期：20150423； 修回日期：20150510

基金項(xiàng)目：國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA10180104）資助

作者簡(jiǎn)介：彭思佳（1990），女，土家族，湖南保靖人，在讀碩士研究生。

Email：psj0945@163.com

蔣建雄為通訊作者。

荻（Miscanthus sacchariflorus）系禾本科黍亞科芒屬多年生的C4植物，具有生長(zhǎng)速度快、生物質(zhì)產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)好、適應(yīng)性廣等優(yōu)良特點(diǎn)[1]。荻主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以北的廣大地區(qū)，野生資源數(shù)量及遺傳多樣性豐富。在北方干旱、半干旱地區(qū)，利用荻干物質(zhì)發(fā)展生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)具有廣闊的前景[2，3]。芒屬植物為高度自交不親和植物，有性繁殖后代個(gè)體間變異較大，因此，生產(chǎn)上荻的種苗繁殖主要采用扦插、分蔸等無(wú)性繁殖方式[4，5]，但是，這些無(wú)性繁殖方法的繁殖系數(shù)有限，育種緩慢[6]，滿足不了產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅種苗繁殖系數(shù)大、可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，并且也是進(jìn)一步開(kāi)展多倍體誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)。

荻的外植體在離體培養(yǎng)過(guò)程中極易褐化，會(huì)影響愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡。在植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象主要由酶促褐變引起[7]，目前已知過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）在酶促褐化過(guò)程中起主要作用，當(dāng)組織中多酚氧化酶被激活，酚類物質(zhì)將被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)[8，9]。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)采取措施，例如添加抗氧化劑、對(duì)外植體材料進(jìn)行前處理和及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基等可以防止或減緩褐化現(xiàn)象，其中添加適宜的抗褐化劑既能抑制褐化也有利于愈傷組織生長(zhǎng)[10]。試驗(yàn)以荻幼穗和愈傷組織為試驗(yàn)材料，研究不同抗褐化劑對(duì)荻愈傷組織誘導(dǎo)及繼代的影響，旨在篩選能提高愈傷組織誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)率的最佳抗褐化劑，以期建立高效的無(wú)性繁殖體系，為今后開(kāi)展多倍體誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞誘變等遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自河北井陘的野生二倍體荻，現(xiàn)種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃，于秋季采荻孕穗期新鮮幼穗作為外植體。

1.2方法

1.2.1外植體的準(zhǔn)備晴天上午10∶00取穎花原基形成期和花粉母細(xì)胞形成期（旗葉抽出長(zhǎng)度2～3 cm時(shí)）大小一致的幼穗于4℃冰箱避光冷藏。24 h后取出幼穗，剝?nèi)ト~鞘和外層苞葉，保留旗葉。在無(wú)菌環(huán)境下用濃度為75%的酒精擦拭幼穗表面，再用0.1%（w/v）升汞滅菌15 min，最后用無(wú)菌水清洗4～5次[11-13]。

1.2.2培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉。愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS+2 mg/L 2，4D+0.1 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉，pH 5.8。在2種培養(yǎng)基中，分別添加過(guò)濾滅菌的3種抗褐化劑聚乙烯吡咯烷酮、抗壞血酸和檸檬酸（表1）。

表1試驗(yàn)處理添加抗褐化劑類型及濃度

Table 1The types and concentrations of antioxidants

處理抗褐化劑類型濃度/g·L-1CK-01PVP0.22PVP0.63PVP1.04Vc0.15Vc0.26Vc0.47CA0.18CA0.29CA0.41.2.3愈傷組織誘導(dǎo)無(wú)菌環(huán)境剝離幼穗，將其切割成0.5 cm長(zhǎng)短，并接入添加不同濃度的PVP，Vc或CA的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使外植體盡量平鋪整個(gè)培養(yǎng)皿。每個(gè)處理重復(fù)3次，在25℃下暗培養(yǎng)。每隔5 d觀察記錄1次外植體褐化和愈傷誘導(dǎo)狀況，30 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.4愈傷組織繼代培養(yǎng)將幼穗誘導(dǎo)出的愈傷組織在愈傷繼代培養(yǎng)基中按表1添加不濃度的PVP，Vc或CA，每個(gè)處理各接入10塊大小相對(duì)均勻的愈傷組織，并稱重，重復(fù)3次。每隔7 d稱重1次并觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織的褐化情況，培養(yǎng)35 d。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

褐化程度采用目視法，褐化等級(jí)劃分為三級(jí)：

+ 外植體輕度褐化，周圍培養(yǎng)基色澤淺；

++ 外植體中度褐化，周圍培養(yǎng)基顏色加深；

+++ 外植體褐化嚴(yán)重，周圍培養(yǎng)基顏色深。

愈傷大小等級(jí)劃分為三級(jí)：

A 等級(jí)為愈傷組織直徑>0.5 cm；

B 等級(jí)為愈傷組織直徑>0.2 cm；

C 等級(jí)為愈傷組織直徑<0.2 cm。

誘導(dǎo)率= （愈傷個(gè)數(shù)/外植體數(shù)）×100%

褐化率=（褐化數(shù)/接種數(shù)）×100%

愈傷增長(zhǎng)量=W1-W0

愈傷組織增長(zhǎng)倍數(shù)=（W1-W0）/W0×100%

記接入繼代培養(yǎng)基時(shí)愈傷組織重量為W0，后期稱量重量為W1。

采用Excel 2007軟件和DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1愈傷組織生長(zhǎng)曲線

在愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加0.2 g/L濃度的Vc可緩解愈傷褐化程度，并可增加愈傷組織的生長(zhǎng)量（表2）。在最佳培養(yǎng)條件下，研究了荻愈傷組織的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)（圖1）。愈傷組織生長(zhǎng)不存在延滯期，接入培養(yǎng)基后，可快速進(jìn)入增殖期以最快速度生長(zhǎng)。21 d至28 d生長(zhǎng)速率降低，直至35 d時(shí)所測(cè)鮮重低于28 d鮮重，此情況應(yīng)該是愈傷組織出現(xiàn)衰老死亡。

圖1荻愈傷組織繼代培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線

Fig.1Growth curve of Miscanthus sacchariflorus

calli during subculture2.2抗褐化劑對(duì)外植體褐化及愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將幼穗接入添加抗褐化劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)外植體的褐化情況和愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)（表2）。結(jié)果表明，在不添加任何抗氧化劑的培養(yǎng)基中，外植體褐化嚴(yán)重，切口處滲出褐色物質(zhì)使周圍培養(yǎng)基顏色改變并加深，誘導(dǎo)出的愈傷組織水漬化以褐色為主（圖2）。

添加PVP對(duì)外植體褐化具有緩解作用，外植體褐變程度降為中度和輕度。當(dāng)PVP濃度從0.2 g/L增大至1.0 g/L，外植體褐變程度逐漸減弱且分泌的褐色物質(zhì)不斷減少；誘導(dǎo)出的愈傷組織為黃色和紫色的顆粒（圖2b，c），不同添加濃度下誘導(dǎo)出的愈傷組織大小與對(duì)照一致為C級(jí)。隨著添加量的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸降低，添加濃度為0.2 g/L時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率最大58.52%，增加至1.0 g/L時(shí)誘導(dǎo)率降低至23.7%，低于對(duì)照43.7%（圖3）。因此，0.2 g/L是荻圖2從荻幼穗誘導(dǎo)出的愈傷組織

Fig.2Calli induced from immature inflorescences

of M.sacchariflorus

注：a.褐色愈傷；b.黃色愈傷；c.紫色愈傷；d.淡黃色愈傷表2抗褐化劑下的外植體和愈傷組織狀態(tài)

Table 2Effect of different antioxidants on explants and callus

處理添加濃

度/g·L-1外植體褐

化程度愈傷顏色愈傷大小CK0+++黃、褐色CPVP0.2++紫、黃色CPVP0.6+紫、黃色CPVP1.0+紫、黃色BVc0.1++紫、黃色BVc0.2++黃、紫色BVc0.4++黃色BCA0.1+++黃、淡黃色BCA0.2+++黃、淡黃色ACA0.4+++A圖3不同PVP濃度下的誘導(dǎo)率

Fig.3Effect of different PVP concentrations

on callus induction rate愈傷組織誘導(dǎo)階段的最適PVP濃度。

在添加不同濃度Vc的處理中，外植體褐化程度都達(dá)中度，褐化程度低于對(duì)照，即Vc能增強(qiáng)外植體的抗褐化能力；在所有添加濃度下誘導(dǎo)出的愈傷組織大小均為B級(jí)黃色和紫色顆粒，且大于對(duì)照C級(jí)（表2）。愈傷組織誘導(dǎo)率隨著添加濃度從0.1到0.4 g/L增加不斷下降。濃度為0.1 g/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最大84.44%，愈傷誘導(dǎo)率提高程度達(dá)極顯著（P<0.01，圖4）。

圖4不同抗壞血酸濃度下和誘導(dǎo)率的影響

Fig.4Effect of different Vc concentrations

on callus induction rate添加不同濃度的CA，外植體褐化程度均為嚴(yán)重，但褐化情況輕于對(duì)照。在添加濃度為0.2和0.4 g/L時(shí)愈傷組織的大小均為大顆粒A級(jí)，0.1 g/L時(shí)為B級(jí)大于對(duì)照C級(jí)。愈傷組織顏色以黃色和淡黃色為主（圖2b，c），濃度增大至0.4 g/L時(shí)有褐色愈傷組織（圖2a）出現(xiàn)。隨著CA添加濃度的增大愈傷組織誘導(dǎo)率先增大后減小。在0.2 g/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最大91.11%，達(dá)極顯著提高（P<0.01），而在0.1 g/L時(shí)最小為51.11%大于對(duì)照43.7%。

圖5不同檸檬酸濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響

Fig.5Effect of different citric acid concentrations

on callus induction rate試驗(yàn)結(jié)果可以看出添加不同抗褐化劑，荻外植體褐化程度強(qiáng)弱依次是CA >Vc> PVP；而獲得的愈傷組織顆粒大小是CA>Vc>PVP，愈傷組織最大誘導(dǎo)率大小為CA>Vc>PVP。

2.3抗褐化劑對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量和褐化的影響

在愈傷組織繼代過(guò)程中向培養(yǎng)基中添加不同濃度的PVP，35后稱量愈傷組織重量，隨著添加濃度的增大，愈傷組織生長(zhǎng)率不斷增大，PVP濃度為1.0 g/L時(shí)獲得的愈傷增長(zhǎng)倍數(shù)最大 ， 最大倍數(shù)是9.43倍，愈傷褐化程度隨著PVP濃度的增加而減弱（表3）。

向培養(yǎng)基中添加不同濃度Vc，結(jié)果表明（表3）隨著添加濃度不斷增大，愈傷組織的重量增加倍數(shù)先增大后減小，最大增加21.38倍，而最小增加3.24倍。褐化率整體下降，褐化率隨著濃度的增加逐漸減小，最小褐化率25.2 %。因此，試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度中0.2 g/L是Vc最適添加濃度，此濃度下愈傷組織的褐化程度下降為輕度，褐化率為25.8%。

由表3可知CA對(duì)愈傷組織繼代的影響隨著添加量增大愈傷組織重量增加倍數(shù)為先增大后減小，0.2 g/L時(shí)愈傷組織最重量增加倍數(shù)是9.54倍。愈傷組織褐化率的變化是隨著CA添加量增大褐化率先增大后減小。

表3不同抗褐化劑對(duì)荻愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

Table 3Effects of antioxidants treatment on Miscanthus

sacchariflorus callus subculture

抗褐化劑初始愈

傷量/g褐化

程度褐化

率/%愈傷組織

增長(zhǎng)量/g增長(zhǎng)

倍數(shù)CK0.53+++100.01.261.34PV（0.2）0.25++67.30.972.88PV（0.6）0.31++65.51.213.91PV（1.0）0.40+60.44.179.43Vc（0.1）0.14+30.62.3916.07Vc（0.2）0.13+25.82.9121.38Vc（0.4）0.29+25.20.942.24CA（0.1）0.37++30.11.462.95CA（0.2）0.24++56.72.539.54CA（0.4）0.24++49.51.374.713討論

褐化現(xiàn)象在芒屬植物組織培養(yǎng)過(guò)程中普遍存在。周樸華等[14]在南荻的無(wú)性系建立研究中報(bào)道繼代和分化過(guò)程中愈傷組織存在褐化死亡現(xiàn)象；周玥玥[15]研究五節(jié)芒時(shí)報(bào)道愈傷組織存在褐化情況；周娜[16]在建立芒轉(zhuǎn)基因體系研究中同樣報(bào)道芒愈傷組織存在褐化現(xiàn)象，并采取及時(shí)轉(zhuǎn)新鮮培養(yǎng)基的措施來(lái)緩解褐化；夏亞男等[10]研究了抗褐化劑對(duì)南荻外植體和愈傷誘導(dǎo)率的影響，指出PVP對(duì)外植體的抗褐化效果最好，檸檬酸能顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率但抗褐化效果不佳。本試驗(yàn)研究了向培養(yǎng)基中添加PVP，抗壞血酸和檸檬酸對(duì)荻外植體褐化和荻愈傷組織生長(zhǎng)的作用。

PVP是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，常用來(lái)吸附酚類物質(zhì)和保護(hù)細(xì)胞器。有研究認(rèn)為它可以吸附酚類物質(zhì)，從而阻止酚類物質(zhì)被氧化為醌類物質(zhì)，使外植體褐化程度降低[17]。吳轉(zhuǎn)娣等[18]研究了愈傷組織誘導(dǎo)階段添加低濃度PVP能有效提高愈傷組織誘導(dǎo)率，本次試驗(yàn)也表明在愈傷組織誘導(dǎo)階段低濃度PVP可以減輕荻外植體的褐化程度和提高愈傷組織誘導(dǎo)率，但高濃度PVP會(huì)降低愈傷誘導(dǎo)率，可能原因是PVP在吸附酚類物質(zhì)的同時(shí)對(duì)培養(yǎng)基中其他激素類物質(zhì)也有吸附[19]，而在愈傷組織繼代培養(yǎng)階段高濃度PVP卻能同時(shí)降低愈傷組織褐化程度和增加了愈傷組織生長(zhǎng)量，有益于愈傷組織生長(zhǎng)，此現(xiàn)象表明褐化在一定程度上會(huì)抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，同時(shí)也說(shuō)明在繼代過(guò)程中愈傷組織對(duì)激素類物質(zhì)的依賴小于誘導(dǎo)過(guò)程。

CA具有酸性，將它添加到培養(yǎng)基中能夠通過(guò)抑制多酚氧化酶的活性來(lái)抑制褐化，但是其對(duì)外植體具有一定的損害作用[17]。本研究顯示在愈傷組織誘導(dǎo)階段它對(duì)荻外植體的抗褐化作用不明顯，卻能夠顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，與PVP和Vc比較它是提高愈傷組織誘導(dǎo)率的最佳添加劑；在愈傷組織繼代階段，CA雖對(duì)愈傷組織具有抗褐化和增加愈傷組織生長(zhǎng)量的作用，但與其他2種抗褐化劑比較效果并非最佳。因此，與另外2種抗褐化劑比較CA僅在愈傷組織誘導(dǎo)階段為提高愈傷組織誘導(dǎo)率的最佳抗褐化劑。

Vc具有還原性，不僅能夠在植物受傷時(shí)清除產(chǎn)生的自由基，還可以通過(guò)將多酚氧化酶中的Cu2+還原成Cu+從而減少酚類物質(zhì)的氧化達(dá)到減輕褐化的作用，因此在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中添加Vc能提高愈傷組織的誘導(dǎo)率[20，21]，此外還具有促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)的作用[22]。試驗(yàn)中，與其他2種抗褐化劑比較，Vc對(duì)荻愈傷組織誘導(dǎo)和愈傷組織生長(zhǎng)的作用并不一致，在3種抗褐化劑中，添加Vc的最大愈傷組織誘導(dǎo)率居中，高于PVP，而低于CA，但在繼代過(guò)程中，添加Vc的愈傷組織生長(zhǎng)速度明顯比添加另外兩種抗褐化劑的快，可能原因是較高濃度Vc能夠消除繼代培養(yǎng)基中更多的有害物質(zhì)且Vc對(duì)愈傷組織的毒害作用小。因此，在愈傷繼代過(guò)程中向培養(yǎng)基中添加Vc能獲得更大量的愈傷組織。

在愈傷組織誘導(dǎo)階段添加PVP荻外植體褐變程度最低，說(shuō)明PVP對(duì)荻外植體的抗褐化作用最好，添加CA極顯著提高了愈傷組織誘導(dǎo)率，最大誘導(dǎo)率高于添加其他2種抗褐化劑的最大誘導(dǎo)率，因此，添加CA是最佳選擇；在愈傷組織繼代階段添加VC獲得的愈傷組織量最大是對(duì)照的21.38倍，以及褐化率低為25.8%，所以是繼代過(guò)程最佳褐化抑制劑，每一種抗褐化劑都在不同階段分別表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，因此，在以后進(jìn)一步研究中，可以考慮將多種不同抗褐化劑配合起來(lái)使用，以達(dá)到最佳的降低愈傷組織褐化和促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)的效果。

綜合分析添加不同濃度PVP、檸檬酸和Vc對(duì)荻外植體的抗褐化作用及愈傷組織誘導(dǎo)的影響，向愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的檸檬酸是荻愈傷組織誘導(dǎo)階段的最佳選擇。在荻愈傷組織繼代過(guò)程中，培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的抗壞血酸對(duì)愈傷組織抗褐化和促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)的效果最佳。荻愈傷組織接入繼代培養(yǎng)基后不存在延滯期而是直接進(jìn)入增殖期，28 d后停止增長(zhǎng)，因此，繼代培養(yǎng)3～4周更換培養(yǎng)基有利于愈傷生長(zhǎng)。

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