汪如婷，雒曉芳*，田丹妮，莫芳芳，馬麟龍

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730100；2.西北民族大學實驗中心，甘肅蘭州730100）

銅綠假單胞菌對萘和菲降解特性研究

汪如婷1，雒曉芳2*，田丹妮1，莫芳芳1，馬麟龍1

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730100；2.西北民族大學實驗中心，甘肅蘭州730100）

研究不同pH和溫度條件下，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）對多環(huán)芳烴中萘和菲的降解效果。結(jié)果表明，以活性炭為吸附載體，多環(huán)芳烴為唯一碳源，將此菌株培養(yǎng)48 h后，pH值為7.0時，萘的降解率可達25.68%，脫氫酶活性達到33.42（μg/mL）·h；菲的降解率可達41.9%，脫氫酶活性達到37.44（μg/mL）·h。當溫度為37℃時，萘的降解率可達27.7%，脫氫酶活性達到33.60（μg/mL）·h；菲的降解率可達34.5%，脫氫酶活性達到39.96（μg/mL）·h。

銅綠假單胞菌；萘；菲；降解率；脫氫酶活性

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指由兩個及兩個以上苯環(huán)組合而成的一類稠環(huán)芳香族化合物，廣泛存在于石油、煤炭中，屬于持久性有機污染物，是世界上最早認識的一類化學致癌物。它具有遠距離遷移性、難降解性和生物累積性［1］，以及潛在的致畸性、致癌性和基因毒性［2］，且其毒性隨著PAHs苯環(huán)的增加而增加，其中的苯并芘是已知的具有極強致癌性的有機化合物。由于這類化合物具有極低的水溶性，在環(huán)境中很難消除，因此，PAHs被美國環(huán)保局和歐共體同時確定為必須要首先控制的污染物，并把其中的16種化合物作為環(huán)境污染的監(jiān)測參數(shù)［3］。美國環(huán)保部（the United States environmental protection agency，USEPA）列出的優(yōu)先控制污染物名單中包括16種多環(huán)芳烴，其中便包括萘（naphthalene，NAP）和菲（phenanthrene，PHE）［4］。多環(huán)芳烴包括自然和人為兩個來源。自然來源形成的PAHs含量極微；而更主要的來源是人類生產(chǎn)和生活，如有機物燃燒、燃煤和煉焦工業(yè)等［5-6］。產(chǎn)生的多環(huán)芳烴會直接進入土壤或通過降雨、降雪和降塵進入土壤，這樣土壤就成為環(huán)境中多環(huán)芳烴的儲藏庫和中轉(zhuǎn)站，且承擔了90%以上多環(huán)芳烴的環(huán)境負荷［7］。近年來，隨著人類生產(chǎn)活動的加劇，使環(huán)境中的PAHs大量增加，破壞了其在環(huán)境中的平衡。因此，如何加快PAHs在環(huán)境中的降解，減少其對環(huán)境的污染，成為人們?nèi)找骊P(guān)注的話題。

近年來，已分離到的PAHs降解菌主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、諾卡氏菌屬（No-cardia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、微球菌屬（Micrococcus）等［8-11］。雖然PAHs降解菌幾乎在各個菌屬中都有分布，但是目前的研究表明，不同的細菌對不同的PAHs的降解能力存在著很大的差別，假單胞菌是目前發(fā)現(xiàn)的降解菌種類最多、降解范圍最廣的菌屬，已發(fā)現(xiàn)的假單胞菌可以降解幾乎所有的四環(huán)以下的PAHs［3］。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）原稱綠膿桿菌，是假單胞菌科假單胞菌屬，是一種常見的革蘭陰性桿菌，在環(huán)境中分布廣泛，具有極強的環(huán)境適應(yīng)能力。韓妍等［2］研究表明銅綠假單胞菌可以以萘等多環(huán)芳烴作為唯一碳源來維持菌體的生長。

本實驗主要研究銅綠假單胞菌對萘、菲的降解作用，以銅綠假單胞菌對萘、菲的降解率和脫氫酶活性為評價指標，考察不同pH值和溫度對菌株降解萘、菲的影響，掌握銅綠假單胞菌對萘、菲的最佳降解條件，為微生物降解多環(huán)芳烴的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)，對提高多環(huán)芳烴污染物的降解效率、促進多環(huán)芳烴處理技術(shù)的發(fā)展，具有十分重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種來源

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是由西北民族大學實驗中心微生物實驗室分離純化而得。

1.1.2試劑

萘、菲、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、環(huán)己烷、活性炭（均為分析純），氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：煙臺市雙雙化工有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SSW-CJ-ZF超凈工作臺、HH.B11.600-BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；ZWY-200D全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；HVE-50全自動高壓滅菌器：日本株式會社平山制作所；ES-300E電子天平：長沙湘平科技發(fā)展有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；UV2300紫外分光光度計：上海天美科學儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌種活化和樣品的制備

將菌種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48 h，得到的種子液于4000r/min離心3min，棄上清。用無機鹽培養(yǎng)基洗滌下層菌體3次，洗滌完畢后用無機鹽培養(yǎng)基制成菌懸液。

樣品的制備：取若干50 mL錐形瓶，分別加入10 g活性炭，按活性炭質(zhì)量比（5%）加入萘或菲，加入適量環(huán)己烷溶液溶解，放于超凈臺中待環(huán)己烷完全揮發(fā)。

1.3.2不同pH下銅綠假單胞菌（PA）對萘、菲的降解

取適量菌懸液，分成6份，在超凈臺中用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)整菌懸液的pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，各取15 mL調(diào)節(jié)pH后的菌懸液加入到對應(yīng)的三角瓶中，每種物質(zhì)設(shè)3個重復組?；旌暇鶆蚝笾糜?7℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，按1.3.4及1.3.5的步驟測定其降解率和脫氫酶活性。

1.3.3不同溫度下銅綠假單胞菌（PA）對萘、菲的降解

取若干已加好萘或菲的錐形瓶，在超凈臺中取15 mL原菌液加入到對應(yīng)的錐形瓶中，每種物質(zhì)設(shè)3個重復組?；旌暇鶆蚝蠓謩e置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，按1.3.4及1.3.5的步驟測定其降解率和脫氫酶活性。

1.3.4萘、菲標準曲線的繪制及降解率測定

用環(huán)己烷分別準確配制質(zhì)量濃度梯度為0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L的萘、菲標準溶液，以環(huán)己烷為對照，分別于波長268 nm和293 nm處用紫外分光光度計下測定吸光度值，繪制出萘和菲的標準曲線［12］。

將剩余的樣品經(jīng)蒸餾提取48 h后，以環(huán)己烷為對照測定餾出液中多環(huán)芳烴類污染物的吸光度值，通過回歸方程來計算萘和菲的殘留量和降解率。萘和菲殘留量和降解率的計算公式如下：

式中：y為吸光度值；V為餾出液體積，L。

式中：m為萘（菲）殘留量，g；M為樣品中原污染物的質(zhì)量，g。

1.3.5TTC標準曲線的繪制及脫氫酶活性的測定

樣品中脫氫酶活性的測定采用張清敏等［13］TTC分光光度法。通過把待測溶液離心后加入TTC和Tris-HCl溶液萃取后于波長486 nm處測定其吸光度值，根據(jù)繪制TTC標準曲線計算出土壤中脫氫酶活性。脫氫酶活性的計算公式如下：

式中：B為脫氫酶活性，（μg/mL）·h；x為TTC質(zhì)量濃度，μg/mL；H為培養(yǎng)時間，h。

2　結(jié)果與分析

2.1TTC標準曲線

以TTC質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制TTC標準曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　TTC標準曲線Fig.1 Standard curve of TTC

由圖1可知，標準曲線線性回歸方程為y=0.013x-0.010 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 9，表明TTC質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

2.2萘和菲的標準曲線

以萘、菲的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，不同質(zhì)量濃度的萘、菲溶液對應(yīng)的吸光度值（y）為縱坐標，繪制萘、菲標準曲線，結(jié)果見圖2。

圖2　萘（A）及菲（B）的標準曲線Fig.2 Standard curve of naphthalene（A）and phenanthrene（B）

由圖2可知，萘的標準曲線線性回歸方程為y=48.25x+ 0.017，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0；菲的標準曲線線性回歸方程為y=71.52x+0.194，相關(guān)系數(shù)R2=0.985 0。結(jié)果表明萘和菲的含量與吸光度值均具有良好的線性關(guān)系。

2.3PA對萘、菲的降解率及脫氫酶活性的影響

2.3.1不同pH值條件下PA對萘、菲降解率的影響

圖3不同pH值條件下銅綠假單胞菌對萘及菲降解率的影響Fig.3 Effect of different pH on degradation rate of naphthalene and phenanthrene byP.aeruginosa

圖3為萘和菲在不同pH值條件下培養(yǎng)48 h后的降解率。由圖3可知，pH值對多環(huán)芳烴的降解率具有較大的影響。當pH＜7.0時，萘和菲的降解率隨之降低；當pH值為7.0時多環(huán)芳烴達到最高降解率，其中萘的降解率達到25.68%，菲的降解率達到41.9%。這是因為銅綠假單胞菌的最適生長pH值為7.0，所以在pH值為7.0時有較好的降解效果。當pH＞7.0時，隨著pH的升高，降解率降低。因此，選擇最佳pH 7.0為宜。

圖4　在不同溫度條件下銅綠假單胞菌對萘及菲降解率的影響Fig.4 Effect different temperature on degradation rate of naphthaleneand and phenanthrene byP.aeruginosa

2.3.2不同溫度條件下PA對萘、菲降解率的影響

圖4為萘和菲在不同溫度條件下培養(yǎng)48 h后的降解率。由圖4可知，溫度對銅綠假單胞菌降解多環(huán)芳烴具有較大的影響。隨著培養(yǎng)溫度的升高，萘和菲降解均上升。25℃時萘的降解率僅為17.58%，菲的降解率為19.44%。隨著溫度的升高，降解率上升速率逐漸提高，當溫度為37℃時，萘和菲的降解率達到最高值，分別為27.7%和34.5%；37℃之后多環(huán)芳烴的降解率開始迅速下降，這可能是因為銅綠假單胞菌的最適生長溫度為37℃，在41℃也能生長，這是銅綠假單胞菌的顯著特點［14］。因此，選擇最佳溫度37℃為宜。

2.3.3不同pH條件下PA降解萘、菲產(chǎn)脫氫酶活性的影響

圖5　在不同pH值條件下銅綠假單胞菌對萘及菲脫氫酶活性的影響Fig.5 Effect of different pH on dehydrogenase activity of naphthalene and phenanthrene byP.aeruginosa degradation

圖5為萘和菲在不同pH值條件下脫氫酶活性的變化。結(jié)合圖3可以看出，脫氫酶活性與降解率變化趨勢基本相同，脫氫酶活性與降解率之間可能存在一定相關(guān)性。在多環(huán)芳烴的降解過程中脫氫酶使多環(huán)芳烴的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，實現(xiàn)多環(huán)芳烴的氧化和轉(zhuǎn)化［15-16］。脫氫酶活性的提高表明微生物生物活動頻繁，有利于多環(huán)芳烴的生物降解。由圖5可知，在pH為4.0～7.0時，脫氫酶活性的升高趨勢較為明顯，同時降解率的增加也有明顯變化；當pH值為7.0時，二者的脫氫酶活性均達到最高值，分別為34.32（μg/mL）·h和37.44（μg/mL）·h；pH＞7.0時，脫氫酶活性迅速下降。因此，選擇最佳pH值7.0為宜。

2.3.4不同溫度條件下PA降解萘、菲產(chǎn)脫氫酶活性的影響

圖6在不同溫度條件下銅綠假單胞菌對萘及菲脫氫酶活性的影響Fig.6 Effect of different temperature on dehydrogenase activity of naphthalene and phenanthrene by P.aeruginosadegradation

圖6為萘和菲在不同溫度條件下脫氫酶活性的變化。結(jié)合圖4可以看出，脫氫酶活性曲線與降解率曲線趨勢基本相同，脫氫酶活性與降解率之間可能存在一定相關(guān)性。由圖6可知，當溫度為25～35℃時，脫氫酶活性的升高趨勢較為明顯，與降解率的升高趨勢相同；當溫度為37℃時，二者脫氫酶活性均達到最高值，分別為33.60（μg/mL）·h和36.96（μg/mL）·h；當溫度＞37℃時，二者的脫氫酶活性均為下降趨勢，結(jié)合圖4可以看出，與降解率降解曲線的趨勢也基本相同。這可能是低溫下由于酶活性的降低使PAHs的生物降解受到抑制。在30～40℃范圍內(nèi)，高溫可以提高PAHs代謝率達到最大值。但超過這個溫度范圍，PAHs的膜毒性會增高［17］。因此，選擇最佳溫度37℃為宜。

3　結(jié)論

以銅綠假單胞菌為研究對象，初步探討了不同pH值和溫度下此菌株對多環(huán)芳烴中萘和菲的降解效果和脫氫酶活性的影響。結(jié)果表明，以活性炭為吸附載體，多環(huán)芳烴為唯一碳源，將此菌株培養(yǎng)48 h后，pH值為7.0時，萘的降解率可達25.68%，脫氫酶活性達到33.42（μg/mL）·h，菲的降解率可達到41.9%，脫氫酶活性達到37.44（μg/mL）·h。當溫度為37℃時，萘的降解率可達27.7%，脫氫酶活性達到33.60（μg/mL）·h，菲的降解率可達34.5%，脫氫酶活性達到39.96（μg/mL）·h?？梢姡琾H值、溫度均對萘菲的降解均有較大的影響，選擇合適的降解條件，提高了萘、菲等多環(huán)芳烴污染物的降解率和脫氫酶活性，可對進一步研究萘菲等多環(huán)芳烴污染物的降解提供參考依據(jù)。

［1］曹云者，柳曉娟，謝云峰，等.我國主要地區(qū)表層土壤中多環(huán)芳烴組成及含量特征分析［J］.環(huán)境科學學報，2012，32（1）：197-203.

［2］韓妍.銅綠假單胞菌菲、萘降解相關(guān)基因的篩選與研究［D］.西安：西北大學碩士論文，2013.

［3］譚文捷，李宗良，丁愛中，等.土壤和地下水中多環(huán)芳烴生物降解研究進展［J］.生態(tài)環(huán)境，2007，16（4）：1310-1317.

［4］王蕾.降解多環(huán)芳烴優(yōu)良菌的篩選分離及代謝性能研究［D］.西安：西安建筑科技大學碩士論文，2007.

［5］WILCKE W.Global patterns of polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）insoil［J］.Geoderma，2007，141:157-166.

［6］WILCKE W，AMELUNG W，KRAUSS M，et al.Polycyclic aromatic hydrocarbon（PAH）patterns in climatically different ecological zones of Brazil［J］.Org Geochem，2003，34（3）:1405-1417.

［7］彭華，王維思.河南省典型農(nóng)業(yè)區(qū)域土壤中多環(huán)芳烴污染狀況研究［J］.中國環(huán)境監(jiān)測，2009，25（2）：61-62.

［8］孫海波.多環(huán)芳烴降解菌的篩選、鑒定、降解特性及鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶的初步研究［D］.濟南：山東大學碩士論文，2009.

［9］王艷，辛嘉英，宋昊，等.生物降解萘的研究進展［J］.中國生物工程雜志，2009，29（9）：119-124.

［10］溫洪宇，廖銀章，李旭東.微生物降解多環(huán)芳烴的研究進展［J］.微生物學雜志，2005，25（6）：73-75.

［11］肖嘉俊，陸貽通.土壤微生物降解多環(huán)芳烴菲的研究進展［J］.科技通報，2009，25（5）：673-679.

［12］雒曉芳，陳麗華，王冬梅，等.兩株降油菌株的分離及其降油特性［J］.中國釀造，2012，31（10）：72-74.

［13］張清敏，李洪遠，王蘭.環(huán)境生物學實驗技術(shù)［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2005.

［14］董慶利，姚遠，趙勇，等.銅綠假單胞菌的溫度、pH值和乳酸鈉主參數(shù)模型構(gòu)建［J］.農(nóng)業(yè)機械學報，2014，45（1）：197-202.

［15］陸昕，陳立，李娟，等.假單胞菌Nwu1-mu對陜北石油污染土壤的生物修復作用研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2010，29（5）：910-917.

［16］馬宏瑞，趙敏，張景飛.假單胞菌DS-III的脫氫酶活性與石油烴降解動力學特性［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學，2007，26（2）：559-562.

［17］思顯佩，曹霞霞，熊建功.微生物降解多環(huán)芳烴的影響因素及機理研究進展［J］.重慶工商大學學報：自然科學版，2009，26（5）：457-461.

Research on the degradation characteristics of naphthalene and phenanthrene byPseudomonas aeruginosa

WANG Ruting1，LUO Xiaofang2*，TIAN Danni1，MO Fangfang1，MA Linlong1
（1.Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China；2.Center of Experiment，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730100，China）

The effect ofPseudomonas aeruginosaon naphthalene and phenanthrene degradation was studied under the condition of different pH and temperature.The results showed that using activated carbon as carrier，polycyclic aromatic hydrocarbons as sole carbon source，when the strain was cultured for 48 h at pH 7，the degradation rate of naphthalene was 25.68%，the dehydrogenase activity reached 33.42（μg/ml）·h，the degradation rate of phenanthrene reached 41.9%，and the dehydrogenase activity reached 37.44（μg/ml）·h.When the temperature was 37℃，the degradation rate of naphthalene was27.7%，the dehydrogenase activityreached 33.60（μg/ml）·h，the degradation rate of phenanthrene was 34.5%，and the dehydrogenase activity reached 39.96（μg/ml）·h.

Pseudomonas aeruginosa；naphthalene；phenanthrene；degradation rate；dehydrogenase activity

Q935

A

0254-5071（2015）10-0082-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.018

2015-09-01

西北民族大學2015年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510742079）；西北民族大學2015年本科生科研創(chuàng)新項目（URIP15166）

汪如婷（1994-），女，本科生。研究方向為環(huán)境微生物。

雒曉芳（1980-），女，副教授，碩士，研究方向為環(huán)境微生物。