李文娟，肖 翠，戴素明，李大志，鄧子牛

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙410128）

柑橘潰瘍?。–itrus bacterial canker disease，CBCD）是由柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri，Xac）引起的一種世界性檢疫病害，嚴(yán)重危害柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。對于非疫區(qū)要嚴(yán)格禁止攜帶潰瘍病菌的柑橘材料流入，加強(qiáng)對柑橘潰瘍病菌的檢測。目前，常用的柑橘潰瘍病菌檢測方法有典型癥狀目測法、組織病理切片法、病原分離物致病性檢測、噬菌體檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和斑點(diǎn)免疫結(jié)合法（DIA）等，但這些方法普遍存在檢測周期長、特異性不強(qiáng)、靈敏度不高的局限性，不能很好地滿足檢驗(yàn)檢疫工作的要求[2]。相比傳統(tǒng)檢測方法，常規(guī)PCR 檢測技術(shù)更快速、更準(zhǔn)確。王中康等[3]根據(jù)柑橘潰瘍病菌全基因組中獨(dú)有的保守蛋白質(zhì)基因序列，設(shè)計(jì)篩選出一對特異性引物（JYF5/R5），能將柑橘潰瘍病菌與非致病性黃單胞菌、野油菜黃單胞菌等近緣種進(jìn)行區(qū)分，且d在健康柑橘樣品中不能擴(kuò)增出條帶。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是對常規(guī)PCR 進(jìn)行改進(jìn)的新型核酸定量技術(shù)，具有實(shí)時(shí)、精確、靈敏等特點(diǎn)。研究表明，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 建立的柑橘潰瘍病菌檢測體系，特異性強(qiáng)，靈敏度比常規(guī)PCR 技術(shù)高2～3個(gè)數(shù)量級[4]。

湖南省是我國重要的柑橘生產(chǎn)基地，其主栽品種冰糖橙常年遭受柑橘潰瘍病危害，急需建立快速準(zhǔn)確的冰糖橙潰瘍病菌檢測方法。研究以常規(guī)PCR 為對照，分析qPCR 檢測柑橘潰瘍病菌DNA 和柑橘潰瘍病菌菌量的靈敏度；同時(shí)，應(yīng)用該方法對接種柑橘潰瘍病菌后的冰糖橙樣品進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，以期為實(shí)現(xiàn)冰糖橙潰瘍病菌早期檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無病毒冰糖橙植株、柑橘潰瘍病菌種均由國家柑橘改良中心長沙分中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備 挑取28℃劃線培養(yǎng)48 h 的柑橘潰瘍病菌單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中，于28℃下200 rpm 振蕩培養(yǎng)20 h；室溫下以8 000 rpm 離心5 m in 收集菌體；用無菌水重懸菌體，并調(diào)整OD600≈0.6 后用系列稀釋法確定菌懸液濃度。

1.2.2 病原菌接種 將不同濃度的潰瘍病菌液接種于冰糖橙葉片上，以無菌水作對照，接種量為5 μL。取樣以接種點(diǎn)為中心用6 mm 打孔器打取圓片，每個(gè)處理打取圓片10 片，重復(fù)3 次，用于后續(xù)DNA 提取和潰瘍病菌檢測。

1.2.3 基因組DNA 的提取 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取柑橘潰瘍病菌DNA，步驟參照說明書。冰糖橙DNA 的提取采用CTAB 法，步驟參考高志明等[5]的方法。

1.2.4 qPCR 反應(yīng)程序 反應(yīng)混合液體系：SYBR Green SuperM ix（Bio-Rad）10 μL，上游引物1 μL（10 μM），下游引物1 μL（10 μM）（引物參照趙云等[2]Xac F06/R06 引物對），反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 m in；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min，16℃保存。

1.2.5 常規(guī)PCR 反應(yīng)程序 反應(yīng)混合液體系：10×Buffer（含Mg2+）2 μL，Taq DNA 聚合酶（全式金公司）0.2 μL（5 u/μL），dNTPs（全式金公司）1 μL（10 mM），上游引物1 μL（10 μM），下游引物1 μL（10 μM）（引物參照趙云等[2]Xac F06/R06 引物對），反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 m in；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min，16℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 檢測柑橘潰瘍病菌DNA 的靈敏度分析

以未感病冰糖橙葉片DNA 為對照，用qPCR 和常規(guī)PCR 對純柑橘潰瘍病菌DNA 和混有植物DNA的柑橘潰瘍病菌DNA 進(jìn)行檢測。從圖1 中可以看出，常規(guī)PCR 檢測純潰瘍病菌DNA 的質(zhì)量下限為2×10-4ng，其中DNA 質(zhì)量在200～2×10-3ng 范圍內(nèi)常規(guī)PCR擴(kuò)增條帶亮度明顯，DNA 質(zhì)量為2×10-4ng 時(shí)條帶亮度微弱，DNA 質(zhì)量為2×10-5ng 及以下數(shù)量級時(shí)，沒有條帶。

從圖2 中可以看出，當(dāng)柑橘潰瘍病菌DNA 混有植物DNA 時(shí)，常規(guī)PCR 檢測下限為2×10-3ng，其中DNA 質(zhì)量在200～2×10-2ng 范圍內(nèi)常規(guī)PCR 擴(kuò)增條帶亮度明顯，DNA 質(zhì)量為2×10-3ng 時(shí)條帶亮度微弱，DNA 質(zhì)量為2×10-4ng 及以下數(shù)量級時(shí)，沒有條帶。由此可見，植物DNA 會影響常規(guī)PCR 擴(kuò)增效果，使其檢測靈敏度下降1個(gè)數(shù)量級。

圖1 Xac DNA 常規(guī)PCR 檢測電泳圖

圖2 Xac DNA 與植物DNA 混合后常規(guī)PCR 檢測電泳圖

從表1 中可以看出，對于純柑橘潰瘍病菌DNA，試驗(yàn)所配置的所有數(shù)量級qPCR 都能檢測到，而常規(guī)PCR 檢測不到2×10-5ng 及以下數(shù)量級；同樣，對于混有植物DNA 的柑橘潰瘍病菌DNA，所有數(shù)量級qPCR 都能檢測到，而常規(guī)PCR 檢測不到2×10-4ng 及以下數(shù)量級。此外，對于混有或不混有植物DNA 的樣品，qPCR 檢測的結(jié)果較為相似，由此可知，植物DNA對qPCR 檢測影響不顯著。

2.2 PCR 檢測柑橘潰瘍病菌量的靈敏度分析

用常規(guī)PCR 和qPCR 對不同濃度柑橘潰瘍病菌液進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3 和表2。由圖3 可知，常規(guī)PCR 檢測柑橘潰瘍病菌菌量下限為40 cfu，其中菌量在4×106～4×102cfu 范圍內(nèi)常規(guī)PCR 擴(kuò)增條帶亮度明顯，菌量為40 cfu 時(shí)條帶亮度微弱，菌量為4 cfu 時(shí)沒有條帶。而由表2 可知，qPCR 所有數(shù)量級都能檢測到，常規(guī)PCR 檢測不到的4 cfu 也能檢測到。

用qPCR 和常規(guī)PCR 對接種不同菌量的冰糖橙樣品DNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4 和表3。從圖4 中可以看出，常規(guī)PCR 檢測柑橘潰瘍病菌接菌量下限為1.5×104cfu，其中接菌量在1.5×107～1.5×105cfu 范圍內(nèi)常規(guī)PCR 擴(kuò)增條帶亮度明顯，接菌量為1.5×104cfu時(shí)條帶亮度微弱，接菌量在1.5×103cfu 及以下數(shù)量級時(shí)沒有條帶。而從表3 中可以看出，qPCR 所有數(shù)量級都能檢測到，常規(guī)PCR 檢測不到的1.5×103cfu 及以下數(shù)量級也能檢測到。

表1 不同DNA 模板qPCR 檢測結(jié)果

圖3 不同菌量的常規(guī)PCR 檢測電泳圖

表2 不同菌量的qPCR 檢測結(jié)果

2.3 利用PCR 對冰糖橙接種后進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測

圖4 接菌量不同的冰糖橙樣品的常規(guī)PCR 檢測

表3 接菌量不同的冰糖橙樣品的qPCR 檢測

通過觀察，接菌量為5×103cfu 的冰糖橙在第9 天開始出現(xiàn)潰瘍病典型病斑。分別用常規(guī)PCR 和qPCR 對接種后不同天數(shù)材料進(jìn)行取樣分析，結(jié)果見圖5 和圖6。由圖5 可知，常規(guī)PCR 僅能在接種后第2 天的樣品中檢測出柑橘潰瘍病菌，且條帶非常微弱；隨著接種后的時(shí)間延長，常規(guī)PCR 擴(kuò)增條帶的亮度逐漸增強(qiáng)。而由圖6 可知，qPCR 在接種后立刻就能在植物樣品中檢測出柑橘潰瘍病菌。隨著時(shí)間推移Cq 值減小，說明接種后潰瘍病菌在逐漸增殖，其中接種后1～3 d增殖緩慢，第4 天開始增殖迅速。

圖5 接種潰瘍病菌后冰糖橙樣品的常規(guī)PCR 檢測

圖6 接種潰瘍病菌后冰糖橙的qPCR 檢測

3 討論

柑橘潰瘍病是柑橘類作物的主要病害，建立快速準(zhǔn)確的診斷鑒定體系是柑橘種植地區(qū)病情監(jiān)測以及柑橘苗木、果品出入境檢驗(yàn)檢疫服務(wù)的迫切需求[6]。試驗(yàn)通過常規(guī)PCR 對柑橘潰瘍病菌DNA 和柑橘潰瘍病菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其檢測靈敏度比qPCR 低1～3個(gè)數(shù)量級，且植物DNA 會影響常規(guī)PCR 對潰瘍病菌DNA 的檢測，使其檢測靈敏度下降1個(gè)數(shù)量級，而qPCR 不受植物DNA 的影響。

相關(guān)研究表明，基于PCR 的檢測方法，柑橘材料制樣會影響PCR 擴(kuò)增，田間病害防治大量施用的多種銅制劑中Cu2+殘存于柑橘葉面，會抑制PCR 擴(kuò)增，制樣時(shí)柑橘組織外滲的色素、多元酚以及氯原酸[7]等物質(zhì)也會抑制PCR 擴(kuò)增，這些物質(zhì)的抑制作用可能導(dǎo)致檢測的假陰性，從而影響病害診斷與病原鑒定。

柑橘潰瘍病菌感染柑橘時(shí)有一定的潛伏期，在潛伏期內(nèi)柑橘植株不表現(xiàn)感病癥狀，采用傳統(tǒng)的檢測方法難以檢測出帶菌但不顯癥的柑橘材料，因此難以避免這類材料流入非疫區(qū)。目前，針對柑橘潰瘍病菌的分子檢測多是利用常規(guī)PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等方法[8]。2012年，Bruno D 等[9]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對Venturia spp. 在蘋果葉片上的動態(tài)生長進(jìn)行監(jiān)控。這表明也可以利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 來監(jiān)控柑橘材料上潰瘍病菌的增殖。研究利用qPCR 和常規(guī)PCR 對接種后冰糖橙樣品進(jìn)行分析，qPCR 即時(shí)就能檢測到柑橘潰瘍病菌，并能觀察到潰瘍病菌先慢后快的增殖趨勢，而常規(guī)PCR 要接種后2 d 才能檢測到柑橘潰瘍病菌，且擴(kuò)增條帶很微弱。由此可見，qPCR 適用于柑橘無癥帶菌材料的早期檢測，這將為qPCR 應(yīng)用于冰糖橙潰瘍病菌檢測提供參考，也將為利用qPCR 實(shí)現(xiàn)冰糖橙潰瘍病菌早期檢測提供依據(jù)。

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