祝英，王治業(yè)，楊暉*，周劍平*

(1.甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

·中藥農(nóng)業(yè)·

桃兒七地下莖內(nèi)生真菌的分離和鑒定△

祝英1，2，王治業(yè)1，楊暉1*，周劍平1*

(1.甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的：探索甘肅興隆山桃兒七內(nèi)生真菌的多樣性和豐度，為鬼臼毒素的獲取方式提供新途徑，保護(hù)瀕危藥用植物桃兒七資源。方法：采用組織塊培養(yǎng)法從一株桃兒七地下莖中分離純化內(nèi)生真菌，利用分子鑒定和常規(guī)的形態(tài)學(xué)方法對重復(fù)出現(xiàn)的4株內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果：本研究采用組織塊內(nèi)生菌分離方法分離純化了20株內(nèi)生真菌，鑒定的4株菌分別是赭曲霉Aspergillusochraceus，Eucasphaeriacapensis，布氏白僵菌Beauvetiabrongniaritii和鐮孢菌Fusariumsp.。結(jié)論：內(nèi)生真菌的多樣性和豐度與桃兒七的生境有關(guān)，甘肅興隆山桃兒七內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬為Aspergillus，Eucasphaeria，Beauvetia和Fusarium。

桃兒七；組織塊培養(yǎng)法；內(nèi)生真菌；分子鑒定；形態(tài)學(xué)鑒定

植物內(nèi)生真菌是自然界普遍存在的。有些內(nèi)生真菌菌株不但能促進(jìn)宿主植物生長、增強(qiáng)宿主抗旱、抗鹽和抗病蟲害的能力[1]，還能產(chǎn)生與宿主植物相同或類似的生物活性物質(zhì)[2]，引起人們對植物內(nèi)生真菌研究的興趣。

近年來，國內(nèi)外已經(jīng)陸續(xù)報道了從多種藥用植物中分離獲得產(chǎn)生藥理活性的內(nèi)生真菌。Kusari[3]和王玉美等[4]分別從喜樹植物中分離到產(chǎn)生喜樹堿及其結(jié)構(gòu)類似物的內(nèi)生真菌。殷紅等[5]從秦艽中分離到產(chǎn)生龍膽苦苷的內(nèi)生真菌。李海燕等[6]從云南中縣桃兒七地下莖的韌皮部分離到一株能產(chǎn)生鬼臼毒素的內(nèi)生真菌。王曉鵬等[7]從小檗科鬼臼亞科兩種重要植物桃兒七和南山荷葉中共分離92種內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)桃兒七內(nèi)生真菌抗真菌活性較強(qiáng)，但未報道這些真菌是否產(chǎn)生鬼臼毒素或其結(jié)構(gòu)類似物。張琨等[8]從桃兒七植株中分離得到產(chǎn)鬼臼毒素類物質(zhì)的真菌4株和產(chǎn)鬼臼毒素單糖甙的真菌2株，均屬于毛霉屬M(fèi)ucor；而楊顯志等[9]從桃兒七植物中篩選出產(chǎn)鬼臼毒素的菌株分別屬于交鏈孢屬Alternaria、青霉屬Penicillium和叢梗孢屬M(fèi)onilia。曲霉屬Aspergillus真菌也是植物常見的內(nèi)生菌，也能產(chǎn)生有價值的生物活性物質(zhì)[6，10-11]。Debbab等[12]從唇萼薄荷中分離到能產(chǎn)生活性物質(zhì)的匍柄霉屬Stemphylium內(nèi)生真菌。同一宿主植物分離到產(chǎn)生物活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌種類不同，這與植物的生境和生長年限有關(guān)。張琨等[8]研究的桃兒七植株來源陜西太白山；而李海燕等[6]從云南省中甸縣的桃兒七地下莖分離28株內(nèi)生真菌，從陜西太白山自然保護(hù)區(qū)的桃兒七地下莖分離到21株內(nèi)生真菌[13]；王曉鵬等[7]的桃兒七采自云南省香格里拉仙人洞，分離到20株內(nèi)生真菌。他們的研究結(jié)果顯示不同生境來源的桃兒七分離到的內(nèi)生菌數(shù)量和種屬存在一定的差異。因此，桃兒七內(nèi)生真菌可能和植株的生境有關(guān)。

桃兒七主要分布在我國的云南、青海、西藏、四川、陜西和甘肅等省，生長在海拔2000～3000 m的林下或山地草叢中。云南和陜西境內(nèi)桃兒七內(nèi)生真菌的研究均有報道，而甘肅是野生桃兒七主要分布區(qū)之一。甘肅境內(nèi)桃兒七內(nèi)生真菌的研究還未見報道。本研究桃兒七植物來源于甘肅省榆中縣興隆山，對該生境下桃兒七地下莖內(nèi)生真菌分離、鑒定，闡述植物內(nèi)生真菌分離鑒定的系統(tǒng)方法，以期為植物內(nèi)生真菌的研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實驗樣品為多年生桃兒七Sinopodophyllumhexandrum采自甘肅省蘭州市榆中縣興隆山國家自然保護(hù)區(qū)，海拔2400 m。采樣時間為2009年8月，選擇結(jié)果實的桃兒七植株，完整的將地下莖挖出，將根圍泥土和根系一起放入取樣袋中，帶回實驗室。以興隆山桃兒七根圍泥土為培養(yǎng)基質(zhì)，將桃兒七地下莖栽種于實驗室溫室內(nèi)備用。

1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

1.3 內(nèi)生真菌的分離、純化和保藏

內(nèi)生真菌分離時，直接從溫室栽培基質(zhì)中挖取桃兒七地下莖，將地下莖用自來水沖洗干凈，選取直徑小于5 mm的地下莖按照下列程序表面消毒：75%酒精浸泡3～5 min，拿到無菌操作臺用無菌水沖洗4次，用0.1%的升汞浸泡1～3 min，再用蒸餾水洗滌4次后，留做接種備用。

為了驗證表面消毒效果，進(jìn)行對照試驗：將上述處理好的桃兒七地下莖切成小段，兩端在酒精燈上燒一下后，種植在培養(yǎng)基上；實驗組：將上述處理好的桃兒七地下莖兩端燒一下，用滅菌手術(shù)刀切掉兩端，再將中間莖段切成3 mm小片，分別種植到PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)3～7d，地下莖切口處長出內(nèi)生真菌菌落。挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上純化，3次轉(zhuǎn)接純化后，轉(zhuǎn)接到PDA斜面上保藏備用。

1.4 內(nèi)生真菌的菌種鑒定

1.4.1 分子鑒定 將純化好的菌種用真菌試劑盒提取總DNA。以提取的總DNA為模板，用真菌ITS rDNA通用引物(引物1序列：5’-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3’；引物2序列：5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測到目的條帶，送樣測序。得到測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，得到相似度較高的菌株。本研究選取了在分離純化過程中重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)較高的4株內(nèi)生真菌進(jìn)行分子鑒定。

1.4.2 形態(tài)鑒定 參照分子鑒定結(jié)果，查閱《中國真菌志》[14]和《真菌的形態(tài)和分類》[15]，根據(jù)分類鑒定要求，對分子鑒定結(jié)果進(jìn)一步驗證和細(xì)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后觀察，對照實驗沒有微生物生長，表明本實驗消毒方法可靠。以地下莖表皮接觸培養(yǎng)基的方式培養(yǎng)時(圖1A、B和C)，每個培養(yǎng)皿中接種6個根段，其中約3～6個地下莖段均有微生物菌落出現(xiàn)：多數(shù)是以絲狀真菌和膠質(zhì)狀菌落共存，此情況的絲狀真菌較難純化。只有少數(shù)地下莖段出現(xiàn)單一菌落(圖1B和C)，但只要橫切面一端長出絲狀真菌菌落，另一端也有相同菌落生長(圖1C)。以地下莖段橫切面接觸培養(yǎng)基的方式培養(yǎng)時(圖1D、E和F)，每個培養(yǎng)皿中接種10個根段，約6～8個根段均能見到絲狀真菌生長，此培養(yǎng)方式膠質(zhì)狀菌落出現(xiàn)較少，多數(shù)以單菌落的形式在上橫切面生長(圖1F和G)，在下橫切面也有菌落生長(圖1E)。由圖1D、E和F實驗結(jié)果可知，絲狀真菌菌落多數(shù)從皮層組織長出，此結(jié)果與桃兒七地下莖真菌分布顯微觀察結(jié)果一致[16]。另外，實驗結(jié)果還表明：從同一條地下莖分離到內(nèi)生菌相似度較高；同一株不同地下莖內(nèi)生菌的差異較大。

A：對照組；B～F：實驗組圖1 桃兒七地下莖內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上的生長情況

2.2 內(nèi)生真菌純化

將PDA平板上地下莖段長出的菌絲分別挑去到PDA培養(yǎng)基上純化，直到純化PDA平板上長出單一菌落(見圖2)，一般純化2～3次即可得到單一菌落。本實驗從興隆山一株桃兒七地下莖用PDA培養(yǎng)基共分離到20株內(nèi)生真菌。

圖2 桃兒七地下莖內(nèi)生真菌純化的部分單菌落菌株

2.3 內(nèi)生真菌鑒定

2.3.1 分子鑒定 鑒定結(jié)果表明它們分別是：赭曲霉Aspergillusochraceus；Eucasphaeriacapensis；白僵菌屬真菌Beauveriasp.和鐮孢菌屬真菌Fusariumsp.

2.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定 4株內(nèi)生真菌的分類地位、形態(tài)特征和基物見表1。通過形態(tài)鑒定[14-15]進(jìn)一步將白僵菌鑒定到種，確定為布氏白僵菌Beauvetiabrongniaritii。

表1 4株桃兒七內(nèi)生真菌的分類地位、形態(tài)和基物

3 討論

3.1 內(nèi)生菌分離方法可行性和局限性

賈粟等[2]采用桃兒七地下莖表面消毒后，用無菌刀片除去外部組織，再將內(nèi)部組織切成0.5 cm×0.5 cm小片種植于PDA培養(yǎng)基上等方法來分內(nèi)生菌。黃杰超等[16]對桃兒七地下莖連續(xù)切片觀察，發(fā)現(xiàn)較粗的地下莖菌絲分布幾率較少，而且內(nèi)生真菌僅存在于皮層細(xì)胞的一至二層處。本研究也曾嘗試用此方法分離桃兒七地下莖內(nèi)生真菌，但發(fā)現(xiàn)除去根外部組織的步驟不僅操作復(fù)雜、容易交叉污染的同時，還容易破壞皮層細(xì)胞，不易觀察到內(nèi)生真菌的著生位點和較純的菌落。利用本研究提供的內(nèi)生真菌分離方法，能可靠的分離純化到根部內(nèi)生真菌。該方法簡單、易于操作。張昆等[8]、楊顯志[9]和李海燕等[6，12]利用該方法成功的分離到多株桃兒七內(nèi)生真菌，但他們沒有提供內(nèi)生菌分離的試驗圖片。本研究提供了內(nèi)生菌的分離圖片，能清晰看到內(nèi)生真菌的著生部位，菌絲、孢子和菌落的生長情況，驗證了該方法對植物根或地下莖內(nèi)生真菌分離的可行性和可靠性。

大量的顯微觀察研究發(fā)現(xiàn)植物根部內(nèi)生真菌菌絲的侵染部位主要集中在皮層細(xì)胞的某些區(qū)域，并不侵染內(nèi)皮層和維管束[16-18]。圖1D、E和F的研究結(jié)果從可培養(yǎng)微生物的角度進(jìn)一步驗證了內(nèi)生真菌只集中在皮層細(xì)胞的某些區(qū)域。因此，在對植物根部內(nèi)生真菌分離時，選擇根的合適部位和可靠的分離方法是十分必要的。

3.2 分子鑒定和形態(tài)鑒定相結(jié)合的鑒定方法

對分離純化的內(nèi)生真菌先進(jìn)行分子鑒定。分子鑒定一般能鑒定到屬，在分子鑒定的基礎(chǔ)上，再有目的地開展形態(tài)鑒定，核對真菌鑒定手冊或真菌志上菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征，對分子鑒定結(jié)果進(jìn)行核對和驗證，并可以在分子鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步細(xì)分。例如在本研究中分子方法對白僵菌菌株只鑒定到屬，結(jié)合形態(tài)學(xué)分類將該菌株鑒定到種，為布氏白僵菌。先分子鑒定再形態(tài)鑒定，不但能減少從海量資料中查找、搜索未知菌株形態(tài)特征的時間，而且還能對分子鑒定結(jié)果進(jìn)行核實、驗證，提高鑒定結(jié)果的可靠性。

3.3 內(nèi)生真菌與宿主植物生境有關(guān)

本研究從甘肅省蘭州市榆中縣興隆山桃兒七地下莖分離到20株內(nèi)生真菌，其中有4株菌在分離過程中重復(fù)出現(xiàn)，經(jīng)鑒定這4株菌分別是赭曲霉Aspergillusochraceus，Eucasphaeriacapensis，布氏白僵菌Beauvetiabrongniaritii和鐮孢菌Fusariumsp.，因此榆中縣興隆山桃兒七地下莖的優(yōu)勢屬為Aspergillus，Eucasphaeria，Beauvetia和Fusarium。李海燕等[6]從采自云南省中甸縣桃兒七地下莖中分離到28株內(nèi)生真菌，并篩選出產(chǎn)活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌。楊顯志等[9]也從云南省中甸縣桃兒七地下莖中分離到28株內(nèi)生真菌并對其分類鑒定，其中叢梗孢屬M(fèi)onilia和青霉屬Penixillium是優(yōu)勢屬，木霉屬Trichoderma、毛霉屬M(fèi)ucor和毛殼菌屬Chaetomium是常見屬，無孢菌群Myceliasterilia、交鏈孢屬Alternaria、曲霉屬Aspergillus和莖點霉屬Phoma為偶見。李海燕等[13]桃兒七植株采自陜西太白山自然保護(hù)區(qū)，從桃兒七根、莖中共分離21株內(nèi)生真菌，其中有一株菌的菌絲和發(fā)酵液均能檢測到桃兒七生物活性物質(zhì)，但未對內(nèi)生真菌鑒定。后來張昆等[8]從陜西太白山桃兒七也分離到20株內(nèi)生真菌，其中絲核菌屬Rhizoctonia2株，交鏈孢屬Alternaria1株，毛霉屬M(fèi)ucor17株。王曉鵬等[7]從云南省香格里拉仙人洞桃兒七分離到35株內(nèi)生真菌，其中鐮孢屬Fusarium、柱孢屬Cylindrocarpon和色串孢屬Torula為活性物質(zhì)生產(chǎn)菌?？梢姡坏貐^(qū)分離到內(nèi)生真菌數(shù)量差別很小，而不同來源的桃兒七地下莖內(nèi)生真菌的種類和豐度存在顯著差異。

曲霉屬Aspergillus內(nèi)生真菌在云南省中緬縣的桃兒七地下莖中是偶見屬，卻是甘肅省榆中縣興隆山桃兒七地下莖的優(yōu)勢屬；而在陜西省太白山自然保護(hù)區(qū)和云南省香格里拉仙人洞生長的桃兒七地下莖中未見報道。Eucasphaeriacapensis是2007年Crous等[19]從澳大利亞和南非桉樹葉中發(fā)現(xiàn)的新種；有報道表明E.capensis是傘形科阿魏屬植物常見的內(nèi)生真菌[20]；金輝等[21]從甘肅省榆中縣萃英山采集的瑞香狼毒植物中也分離到該菌，本研究從榆中縣興隆山的桃兒七地下莖也分離到該菌，而且是桃兒七地下莖的優(yōu)勢屬之一。興隆山和萃英山均在榆中縣境內(nèi)，但兩山植被和地質(zhì)結(jié)構(gòu)差異巨大，興隆山是祁連山山系東延部分，是石質(zhì)山地；而萃英山為黃土高原典型的土梁山，在不同植物中均能分離到E.capensis內(nèi)生真菌，而陜西省太白山自然保護(hù)區(qū)、云南省香格里拉仙人洞和中緬縣的桃兒七地下莖中均未分離到該菌，表明內(nèi)生真菌與宿主植物生長的地理位置有一定的關(guān)系。冬蟲夏草屬Cordyceps也是榆中縣興隆山桃兒七地下莖內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬之一，在其它地方的桃兒七地下莖中還未見報道。鐮孢屬Fusarium也是榆中縣興隆山桃兒七地下莖內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬之一，王曉鵬等[7]從云南省香格里拉仙人洞桃兒七也分離到產(chǎn)活性物質(zhì)的鐮孢屬Fusarium內(nèi)生真菌?？梢?，桃兒七內(nèi)生真菌種類和數(shù)量與生境密切相關(guān)。因此，不同產(chǎn)地桃兒七地下莖鬼臼脂素的含量也存在差異，甘肅桃兒七地下莖鬼臼脂素的含量最高為4.2%，陜西次之為3.4%，西藏為3.1%，青海鬼臼脂素的含量最少為2.7%，這些差異可能與內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌群和宿主植物生境密切相關(guān)。

3.4 存在問題及下一步研究計劃

本研究僅對重復(fù)分離到的4株菌株進(jìn)行了分類學(xué)鑒定，剩余的16株內(nèi)生真菌還需要進(jìn)一步分離鑒定。另外，還需從20株內(nèi)生真菌中篩選出產(chǎn)鬼臼毒素及其結(jié)構(gòu)類似物等藥用活性成分的優(yōu)良菌株。

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IsolationandIdentificationofEndophyticFungiObtainedfromUndergroundStemsofSinopodophyllumhexandrum

ZHUYing1，2，WANGZhiYe1，YANGHui1*，ZHOUJianping1*

(1.InstituteofBiology，GansuAcademyofSciences，Lanzhou730000，China) (2.StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems，SchoolofLifeSciences，LanzhouUniversity，Lanzhou730000，China)

Objective：This study investigated the diversity and abundance of endophytic fungi ofSinopodophyllumhexandrumin Xinglong Mountain，Gansu Province，in order to provide a new way for obtaining podophyllotoxin from endophytic fungi，and protect endangered medicinal plants.Methods：TheS.hexandrumendophytic fungi were isolated by tissue culture method，and identified with molecular and morphological data.Results：Twenty endophytic fungi were obtained fromS.hexandrumunderground stems，and four recurring endophytic fungi were identified asAspergillusochraceus，Eucasphaeriacapensis，BeauvetiabrongniaritiiandFusariumsp.Conclusion：Endophytic fungi diversity and abundance were related with host plants and environments，and the dominant endophytic genera inS.hexandrumin Xinglong Mountain areAspergillus，Eucasphaeria，BeauvetiaandFusarium.

Sinopodophyllumhexandrum；tissue culture；endophytic fungi；molecular identification；morphological identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.013

2014-11-05)

國家科技支撐計劃(2012BAD14B10)；科技部國際合作項目(2013DFA30950)；國家星火計劃項目(2010GA860003)；甘肅省民生計劃項目(1209FCMA003)；甘肅省青年科技基金計劃(1208RJYA058)；甘肅省科學(xué)院開發(fā)與應(yīng)用基金項目(2012JK-03)；甘肅省科學(xué)院青年基金項目(QN-2014-03)

*

楊暉，研究員，研究方向：藥用植物生態(tài)學(xué)；Tel：(0931)8613554；E-mail：yanghui43@126.com 周劍平，研究員，研究方向：資源微生物應(yīng)用；Tel：(0931)8613554；E-mail：zhjp8818@163.com