何子龍，方文娟，張方博，楊洪軍，劉釗，楊鴻*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響△

何子龍1，2，方文娟1，張方博2*，楊洪軍2，劉釗3，楊鴻3*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700)

目的：研究疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響。方法：采用外翻腸囊法制備不同濃度的疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液，1 μg·mL-1脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7制備炎癥模型，液相蛋白芯片技術(shù)檢測細(xì)胞因子在正常組、模型組、給藥組表達的具體水平。結(jié)果：含疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液能降低IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、TNF-α13種細(xì)胞因子的表達水平，且與雷公藤內(nèi)酯醇組效果相當(dāng)。結(jié)論：疏風(fēng)解毒膠囊抗炎作用的機制與抑制上述炎癥因子的釋放有關(guān)。

疏風(fēng)解毒膠囊；腸吸收液；細(xì)胞因子；抗炎

炎癥反應(yīng)開始于炎癥細(xì)胞的黏附、遷徙、浸潤、活化及炎癥因子的釋放，這些炎癥細(xì)胞產(chǎn)物之間相互促進，并與細(xì)胞內(nèi)各種轉(zhuǎn)錄因子相互聯(lián)系，使早期炎癥反應(yīng)放大和持續(xù)。脂多糖(LPS)侵入機體后可以激活單核巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其釋放大量的促炎因子和介質(zhì)，如白介素類IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1等，調(diào)節(jié)這些炎癥分子的生成是治療各種與炎癥相關(guān)疾病的重要靶點。

液相蛋白芯片由于高通量、自動化、快速、敏感以及多元化等特點，可檢測多種細(xì)胞信號分子的表達水平，適用于細(xì)胞因子表達的系統(tǒng)研究[1]。中藥多為口服制劑，經(jīng)過消化道和腸道菌群，被直接排泄或選擇性吸收，只有被吸收的藥物才能在體內(nèi)發(fā)揮作用。腸囊外翻(VEIS)技術(shù)作為一種成熟穩(wěn)定的體外腸吸收模型，已經(jīng)被廣泛用于藥物的吸收、代謝等研究中[2]。與血清藥理學(xué)相比，腸吸收液的成分多、含藥量較高、干擾性成分少、活性顯著。

疏風(fēng)解毒膠囊是由虎杖、連翹、板藍根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草等組成的中藥復(fù)方制劑，具有疏風(fēng)清熱，解毒利咽之功能，用于治療急性上呼吸道感染(屬風(fēng)熱證)。其對傷寒桿菌內(nèi)毒素引起的大鼠發(fā)熱反應(yīng)、炎癥早期的滲出水腫(耳廓腫)有明顯抑制作用。疏風(fēng)解毒膠囊對流感病毒感染的預(yù)防具有保護作用[5]。疏風(fēng)解毒膠囊可抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，可減輕內(nèi)毒素導(dǎo)致的肺損傷反應(yīng)[6]。

本研究利用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥細(xì)胞模型，應(yīng)用液相蛋白芯片技術(shù)，通過測定疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液對該模型細(xì)胞因子表達譜的影響，對其抗炎作用機制進行系統(tǒng)全面地研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bio-Plex 200懸液芯片系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；電子分析天平(BP110S型，Sartorius 公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(EYELA SB-1100型，EYELA公司)；循環(huán)水真空泵(SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；超聲清洗器(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；組織-器官水浴系統(tǒng)(ALC-M型，上海奧爾科特生物科技有限公司)；超級潔凈工作臺(SCB-1360型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-18AIC型，三洋電機株式會社)。

1.2 材料

大腸桿菌脂多糖(LPS)(L2630，美國sigma公司)；雷公藤內(nèi)酯醇(中國食品藥品檢定研究院)；疏風(fēng)解毒膠囊(安徽濟人藥業(yè)有限公司，批號：140902)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：140527)；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：8113138)；HyClone雙抗Penicillin-Streptomycin(美國Thermo公司，批號：J130071)；胰酶(北京賽馳生物科技有限公司，批號：140622)。

清潔級SD大鼠，雄性，體重(240±20)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，合格證號：SCXK(京)2009-0017。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。

2 方法

2.1 藥品配制

雷公藤內(nèi)酯醇、LPS分別溶于高糖DMEM培養(yǎng)液中，參考黃斌等[3]利用腸囊外翻法制備疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液的方法，實驗前大鼠禁食12 h，脫臼處死，剪開腹腔，依次迅速取出4段相應(yīng)腸段，腸囊外翻后，結(jié)扎加入臺式液，在組織-器官水浴系統(tǒng)中加入疏風(fēng)解毒膠囊供試液，通入95%O2、5%CO2的混合空氣，37 ℃恒溫2 h后，合并腸吸收液。溶液用0.22 μm過濾器過濾，分裝保存于1.5 mL錐形離心管中，-20 ℃保存，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液。

2.3 細(xì)胞分組及處理

實驗分為正常對照組(空白腸吸收液)、模型組(1 μg·mL-1LPS)、雷公藤內(nèi)酯醇組(0.006 4 μg·mL-1)、疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液不同劑量組(劑量分別為62.5、31.25、15.625、7.812 5、3.906 3 μg·mL-1)。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞進行實驗，棄去原培養(yǎng)液，加入適量高糖DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)吹打制成1×105個/mL的單細(xì)胞懸液。24孔細(xì)胞板，每孔接種1 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后依照實驗分組，加入不同濃度的疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液和雷公藤內(nèi)酯醇，孵育4 h后加入LPS(1 μg·mL-1)進行刺激。20 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，凍存于-80 ℃超低溫冰箱，備用。

2.4Bio-PLex 200液相蛋白芯片分析系統(tǒng)檢測細(xì)胞因子

取待檢測細(xì)胞上清液樣品，室溫溶解后，10 000 r·min-1高速冷凍離心10 min，上清液用緩沖液稀釋(1∶10)。依據(jù)試劑盒說明，在96孔磁珠板上標(biāo)記空白對照、標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品標(biāo)號。每孔加入50 μL偶聯(lián)有抗細(xì)胞因子抗體的檢測磁珠，洗滌2次。向相應(yīng)孔板加入50 μL Bio-plex緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液、待檢測細(xì)胞上清液樣品，室溫避光，500 r·min-1搖床上孵育30 min，洗滌3次。依次分別加入50 μL檢測抗體和50 μLSteptavidin-PE熒光色素，每孔加入125 μL緩沖液重懸微珠，放入Bio-plex-200液相芯片檢測系統(tǒng)，讀取各孔熒光強度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強度計算出樣品中白介素類因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、小鼠角化細(xì)胞性細(xì)胞因子(KC)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)共14種細(xì)胞因子濃度。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

在正常RAW264.7細(xì)胞中，各種細(xì)胞因子均有較低表達，經(jīng)LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞表達大量的細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，LPS模型組與對照組相比，IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、MCP-1、G-CSF、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、KC細(xì)胞因子表達水平極顯著升高(P<0.01)，IL-2細(xì)胞因子表達水平顯著升高(P<0.05)；雷公藤內(nèi)酯醇對IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、GM-CSF、IFN-γ、KC、MCP-1、TNF-α的表達水平有明顯的下調(diào)作用(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達各種細(xì)胞因子的影響

注：與對照組比較1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較3)P<0.01，4)P<0.05。

4 討論

液相蛋白芯片技術(shù)被喻為后基因組時代的新型芯片技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)和核酸等生物分子的高通量檢測平臺。其同步性好、通量大、準(zhǔn)確性高等特性能很好地突破傳統(tǒng)中藥研究中單個散在指標(biāo)的局限性，節(jié)約珍貴樣本，提高中藥研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，比較全面系統(tǒng)地闡明中藥多靶點的作用機制。外翻腸囊保留了完整的組織和黏膜特性，可模擬體內(nèi)生理狀態(tài)下不同腸段對藥物的吸收情況[4]，與提取物比較腸吸收液的實驗結(jié)果與體內(nèi)實驗一致；與血清藥理學(xué)比較，腸吸收液排除了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，且藥效顯著，適用于口服制劑藥物的研究。

疏風(fēng)解毒膠囊對于炎性反應(yīng)的抑制機制可能與抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路，下調(diào)NF-κBmRNA的表達有關(guān)[7]。疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液通過抑制IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4的表達，可抑制傳遞抗原的細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞活化，減弱B細(xì)胞增殖和抗體分泌，抑制其他細(xì)胞因子產(chǎn)生和急性期蛋白的合成來降低炎癥反應(yīng)；同時，抑制IL-10、IL-12(p70)、IL-13誘導(dǎo)的單核細(xì)胞分化，調(diào)控單核細(xì)胞因子分泌，控制炎癥反應(yīng)；降低粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的表達，減少粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落；抑制IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞一氧化氮合酶(iNOS)的產(chǎn)生，從而減少NO的合成；有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介質(zhì)的分泌和釋放，阻止了炎癥的擴大化和級聯(lián)反應(yīng)。其中IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，可通過促進釋放前炎性細(xì)胞因子來放大炎癥反應(yīng)，激活和刺激T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6、IL-8、GM-CSF和細(xì)胞黏附分子-1(CAM-1)等，從而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。疏風(fēng)解毒膠囊腸吸收液可能通過抑制IL-17的表達，降低細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制中性粒細(xì)胞的活化，減輕炎癥反應(yīng)。

本研究顯示，疏風(fēng)解毒膠囊制備的腸吸收液能通過有效抑制多種細(xì)胞因子的釋放，發(fā)揮多靶點抗炎效果，減輕系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，起到顯著的抗炎作用。因此，應(yīng)用外翻腸囊法，結(jié)合蛋白芯片研究技術(shù)可以對中藥復(fù)方及其成分藥效、分子機制進行系統(tǒng)準(zhǔn)確地分析研究。

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EffectofIntestinalAbsorptionLiquidContainingBreezeDetoxificationCapsuleonLPS-inducedCytokinesReactioninMacrophage

HEZilong1，2，F(xiàn)ANGWenjuan1，ZHANGFangbo2*，YANGHongjun2，LIUZhao3，YANGHong3*

(1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicinecollegeofpharmacy，Jangxi，NanChang330004，China；2.InstituteofChineseMateriaMedicaChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；3.ExperimentalResearchCenterChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To study the effect of the intestinal absorption liquid containing Breeze Detoxification Capsule(BDC)on LPS-induced cytokines expression in macrophage.Methods：The liquid protein chip was applied to detect the influence of BDC intestinal absorption liquid on cytokines released by LPS-induced macrophage RAW264.7 based on mice inflammation model.Result：The BDC intestine absorption liquid reduced the cytokine expression level of IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-10，IL-12(p70)，IL-13，IL-17，G-CSF，GM-CSF，IFN-γ，KC，TNF-α，totally 13 kinds，which had similar effects with triptonide group.Conclusion：The anti-inflammatory mechanism of BDC might be related to inhibition of inflammatory cytokine release.

Breeze detoxification capsules；intestinal absorption liquid；Cytokines；anti-inflammatory

2015-01-13)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(200907001-5)

*

張方博，博士，研究方向：藥理學(xué)研究；E-mail：zhangfangbo68@163.com 楊鴻，博士，副研究員，研究方向：中醫(yī)證侯系統(tǒng)生物學(xué)及中藥復(fù)方配伍的分子機制研究；Tel：(010)64014411-3327，E-mail：leslie18029@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.012