弓 寶，陳德力，劉洋洋，方 草，王德立，楊新全*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所，海南 萬(wàn)寧 571533；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院，海南 海口 570311)

·基礎(chǔ)研究·

牛大力根油脂抗氧化活性研究△

弓 寶1，陳德力1，劉洋洋1，方 草2，王德立1，楊新全1*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所，海南 萬(wàn)寧 571533；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院，海南 海口 570311)

目的：研究牛大力根油脂抗氧化活性。方法：將牛大力根干燥粉末用70%乙醇浸提，結(jié)合硅膠柱層析分離，獲得牛大力根油脂提取物F-1和F-2，同時(shí)采用加熱回流法提取獲得牛大力根油脂提取物F-3，并以DPPH法和FRAP法對(duì)各油脂提取物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：在DPPH法中，F(xiàn)-1、F-2及F-3的半數(shù)最高抑制濃度(IC50)值分別為203.18、138.38、244.10 μg·mL-1，其FRAP值分別為(7 712.2±274.7)、(10 387.5±280.5)、(4 584.1±182.3) μmol Fe2+·g-1?？箟难?Vc)和BHT的IC50值分別為11.59、53.69 μg·mL-1，F(xiàn)RAP值分別為(17 356.1±622.9)、(13 235.4±469.5) μmol Fe2+·g-1。結(jié)論：牛大力根油脂具有一定的抗氧化活性，且以F-2最強(qiáng)。

牛大力；油脂；抗氧化

牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤M(fèi)illettiaspeciosaChamp.的根，別名豬腳笠、山蓮藕、大力薯、大力牛等[1]，以根入藥，載于《陸川本草》，全年可采。牛大力具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)的功效，可用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺熱、肺虛咳嗽、肺結(jié)核、慢性支氣管炎和慢性肝炎、病后體虛等病癥[2]。在廣東、廣西、海南等地還廣泛用作煲湯原料，可補(bǔ)腰腎、強(qiáng)筋骨，為嶺南地區(qū)著名的藥食兩用植物。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)牛大力根及葉化學(xué)成分的研究表明，牛大力中含有三萜皂苷、異黃酮、查爾酮、多糖、香豆素、生物堿等類(lèi)成分，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗炎、抗腫瘤、祛痰平喘等活性，是一味具有多種藥理作用和良好保健功效的南藥[3-6]。目前，未見(jiàn)牛大力根油脂抗氧化活性的研究報(bào)道。據(jù)此，本文對(duì)牛大力油脂的抗氧化活性進(jìn)行了研究，為牛大力資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，本項(xiàng)目組對(duì)牛大力根的脂溶性成分進(jìn)行了提取與分離富集，并采用DPPH法和FRAP法對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用牛大力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用牛大力根，于2013年10月采自海南省五指山參毛陽(yáng)鎮(zhèn)，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所馮錦東研究員鑒定為MillettiaspeciosaChamp.的根。采后曬干粉碎，放置干燥暗處貯存?zhèn)溆谩?/p>

2，2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH，A Johnson Matthey Company)，2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT，廣州化學(xué)試劑廠，分析純)，2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，Sigma)，抗壞血酸(Vc)、無(wú)水醋酸鈉、無(wú)水醋酸、FeCl3·6H2O、鹽酸(廣州化學(xué)試劑廠，AR)，石油醚、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO)、95%乙醇均為分析純。

1.2 儀器

xMARK微孔板分光光度計(jì)(美國(guó)BIO-RAD公司)、BT224S電子天平(德國(guó)Sartorious公司)，移液器(20 μL、200 μL，DRAGON-MED)。

2 方法

2.1 試樣的制備

牛大力根干燥粉末2.5 kg，用70%乙醇水溶液(10 L × 3)室溫提取7 d，減壓濃縮至無(wú)醇味，得浸膏250 g。將所得浸膏分散于水中成懸濁液，以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，減壓濃縮得石油醚萃取物10 g。取石油醚萃取物，硅膠柱色譜(200～300 目，40 g)干法上柱，以石油醚-乙酸乙酯(99∶1)梯度洗脫，采用TLC 檢測(cè)合并相同餾分，得到12個(gè)部位，其中F-1(550 mg)和F-2(1.472 8 g)為脂溶性成分，溶解于DMSO，過(guò)濾，備用。

取200 g牛大力根干燥粉末，置于2 L燒瓶中，加入1000 mL石油醚，70 ℃加熱回流萃取4 h，取萃取液過(guò)濾，減壓濃縮，得到脂溶性成分F-3(2.565 4 g)，溶解于DMSO，過(guò)濾，備用。

精確稱(chēng)取F-1、F-2及F-3各10 mg，溶解于10 mL DMSO溶液中，制成1 mg·mL-1的母液試樣，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)時(shí)配制成500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、10 μg·mL-1的樣品溶液。

2.2 陽(yáng)性對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg抗壞血酸(Vc)，用蒸餾水溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得1 mg·mL-1抗壞血酸的母液，再稀釋配制質(zhì)量濃度分別為40、30、20、10、5、1 μg·mL-1的樣品溶液。

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg BHT，用蒸餾水溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得1 mg·mL-1BHT的母液，再稀釋配制質(zhì)量濃度分別為100、80、60、40、20、10 μg·mL-1的樣品溶液。

2.3 DPPH自由基清除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[7-8]的方法，進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化。在96孔板中按表1加樣，分別在517 nm處測(cè)定Ao、Ai、Aj在30 min后的吸光度，每一個(gè)試樣做3個(gè)平行樣，取平均值。按公式計(jì)算樣品對(duì)自由基的清除率。并采用藥物代謝動(dòng)力學(xué)模型擬合，計(jì)算不同樣品在對(duì)DPPH清除率為50%時(shí)的濃度(即IC50)，對(duì)不同溶劑提取的樣品抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，即IC50越小，抗氧化能力越強(qiáng)。

清除率(%)=(1-)×100% (1)

注：Ao，DPPH溶液反應(yīng)前的吸光值；Ai，樣品與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光值；Aj，空白對(duì)照的吸光值。

2.4 FRAP試驗(yàn)

2.4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 吸取2.5 mL系列濃度為25、100、 150、200、400、500、800、1000、1500 μmoL·L-1的硫酸亞鐵(FeSO4)溶液，與2.5 mL 10 mmol·L-1TPTZ溶液、25 mL 300 mmol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH3.6)混合，再分別吸取該混合液200 μL加入96孔酶標(biāo)板中，放入 x-Mark酶標(biāo)儀內(nèi)，升溫至37 ℃，于593 nm下讀取吸光值。以FeSO4溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4.2 試樣抗氧化活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7，9-10]的方法，即吸取2.5 mL 20 mmol·L-1FeC13溶液，與2.5 mL 10 mmol·L-1TPTZ溶液、25 mL 300 mmol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH3.6)混合，再吸取該混合液150 μL加入96孔酶標(biāo)板中，放入xMark酶標(biāo)儀內(nèi)，升溫至37℃，于593 nm下讀取反應(yīng)前吸光值A(chǔ)1(TPTZ本身有顏色)，之后在孔中加入50 μL 1 mg·mL-1的待測(cè)抗氧化物質(zhì)。30 min后于593 nm處讀取反應(yīng)后吸光值A(chǔ)2。由(A2-A1)的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得抗氧化物質(zhì)相應(yīng)的FeSO4的濃度(μmol·L-1)，再轉(zhuǎn)換成量綱為μmol·g-1，定義為FRAP值。FRAP值越大，表明由抗氧化物質(zhì)還原的Fe2+越多，即抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)。所有的試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 清除DPPH自由基能力

DPPH 在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，具有單一電子，在波長(zhǎng)為517nm 下具有最大吸光值，有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH 的單電子被捕捉而使其顏色變淺，是有效評(píng)價(jià)抗氧化活性的體外模型之一。

以抗壞血酸及BHT為陽(yáng)性對(duì)照組，其與自由基反應(yīng)30 min后的最終清除率對(duì)樣品質(zhì)量濃度作圖，采用藥物代謝動(dòng)力學(xué)函數(shù)擬合，結(jié)果見(jiàn)圖1，計(jì)算得Vc的IC50=11.59 μg·mL-1(r=0.994 4)；BHT的IC50=53.69 μg·mL-1(r=0.995 5)，具有很好的相關(guān)性。

圖1 Vc和BHT對(duì)DPPH自由基清除率曲線

以提取、分離純化所得牛大力根油脂樣品對(duì)DPPH的最終清除率與質(zhì)量濃度作圖，采用藥物代謝動(dòng)力學(xué)函數(shù)模型進(jìn)行擬合，并計(jì)算其IC50值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同樣品質(zhì)量濃度與其最終清除率的關(guān)系圖

由圖2可以看出，牛大力根油脂F(xiàn)-1的IC50值為203.18 μg·mL-1(r=0.998 8)，F(xiàn)-2的IC50值為138.38 μg·mL-1(r=0.996 4)，F(xiàn)-3的IC50值為244.10 μg·mL-1(r=0.999 6)。比較可知，F(xiàn)-2對(duì)自由基DPPH的清除效果較好，其次分別為F-1、F-3。

3.2 FRAP值測(cè)定結(jié)果

Fe3+吡啶三吖嗪可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價(jià)鐵形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于593 nm 處具有最大吸收值，根據(jù)吸光度大小計(jì)算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱，F(xiàn)RAP值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。由圖3可以看出，5種不同樣品均表現(xiàn)出一定的還原力，以Vc最為顯著，F(xiàn)RAP值為(17 356.1 ± 622.9) μmol Fe2+·g-1，其次為BHT、F-2、F-1及F-3，F(xiàn)RAP值分別為(13 235.3±469.5)、(10 387.5±280.5)、(7 712.2±274.7)、(4 584.1±182.3) μmol Fe2+·g-1。

注：不同小寫(xiě)字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖3 不同樣品鐵離子還原能力圖

由于不同抗氧化檢測(cè)方法的反應(yīng)機(jī)理不同，為獲得可靠的結(jié)論，以樣品的IC50和FRAP值為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較DPPH法與FRAP法的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩種方法的結(jié)果具有很好的線性關(guān)系(r=0.971)，說(shuō)明此兩種方法的結(jié)果具有很好的相關(guān)性和一致性。因此，IC50和FRAP值可視為樣品觀測(cè)的2個(gè)同量綱的抗氧化活性指標(biāo)。綜合DPPH法與FRAP法的結(jié)果表明，牛大力根部油脂具有較好的抗氧化活性，其中F-2部位的油脂抗氧化活性較F-1和F-3的活性強(qiáng)，這可能與F-2中富集含量較高的不飽和脂肪酸及其他抗氧化劑含量有關(guān)。

4 結(jié)論

牛大力為著名的藥食兩用植物，在廣東、廣西以及海南等地有大規(guī)模的種植栽培，具有重要的研究與開(kāi)發(fā)價(jià)值。以上研究結(jié)果表明牛大力根油脂具有較好的抗氧化活性，其中可能存在大量的天然抗氧化活性物質(zhì)，可開(kāi)發(fā)成安全有效的抗氧化活性劑，在功能性食品、藥品、保健產(chǎn)品、日化產(chǎn)品等行業(yè)具有廣闊的研究與應(yīng)用前景。

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AntioxidantActivityofLipidsfromMillettiaspeciosaRoot

GONGBao1，CHENDeli1，LIUYangyang1，F(xiàn)ANGCao2，WANGDeli1，YANGXinquan1*

(1.HainanBranchInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Wanning571533，China；2.HainanProvincialNongKenHospital，Haikou，570311，China)

Objective：The aim of this study was to investigate the antioxidant activities of lipids from theMillettiaspeciosaroot.Methods：The lipophilic extracts F-1 and F-2 were isolated from the dry root ofM.speciosaby 70% ethanol extraction method and silica column chromatography.Meanwhile，lipophilic extract F-3 was extracted by heat reflux.Whereafter the antioxidant activity of F-1，F(xiàn)-2 and F-3 extracts were investigated by means of DPPH and FRAP assay.Results：The results showed that the half inhibitory concentration (IC50) of extracts of F-1，F(xiàn)-2 and F-3 were 203.18，138.38 and 244.10 μg·mL-1，respectively，with DPPH method，and their FRAP values were (7 712.2±274.7)，(10 387.5±280.5) and (4 584.1±182.3) μmol Fe2+·g-1，respectively，as well.The IC50of ascorbic acid (Vc) and BHT were respectively 11.59 and 53.69 μg·mL-1，and their FRAP values were (17 356.1±622.9)，(13 235.4±469.5) μmol Fe2+·g-1.Conclusion：The oil fractions are moderate to good in scavenging effect on DPPH radical and reducing power.

Millettiaspeciosa；lipids；antioxidant activity

2015-01-07)

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2013HNB02)；海南省自然科學(xué)基金(20152019)

*

楊新全，副研究員，研究方向：南藥研究與開(kāi)發(fā)；E-mail：yangxinquan@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.009