趙香妍，劉長(zhǎng)利，薛文峰，張夏楠，羅容

(首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

·專題·

北京地區(qū)野生柴胡種質(zhì)資源的ISSR研究△

趙香妍，劉長(zhǎng)利*，薛文峰，張夏楠，羅容

(首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

目的：通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)考察北京地區(qū)野生柴胡不同種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系。方法：從43條引物中篩選出8條合適的引物，對(duì)北京地區(qū)不同產(chǎn)地采集的15份野生柴胡種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分析，構(gòu)建聚類系統(tǒng)樹狀圖。結(jié)果：8條引物共擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性條帶114條，占87.7%，聚類分析顯示北京地區(qū)野生柴胡遺傳多樣性較高，并存在明顯的種內(nèi)遺傳變異。結(jié)論：北京地區(qū)野生柴胡呈現(xiàn)一定的地域性分布趨勢(shì)，應(yīng)加以保護(hù)，初步認(rèn)為百花山山腰及山腳柴胡值得推廣種植，研究為北京地區(qū)柴胡種質(zhì)親緣關(guān)系研究及栽培品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

柴胡；ISSR；北京地區(qū)；種質(zhì)資源；親緣關(guān)系

柴胡(Bupleuri Radix)是被中國(guó)藥典所收錄的傳統(tǒng)常用大宗中藥材之一，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽(yáng)氣等功效。藥典規(guī)定柴胡為傘形科柴胡屬植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根[1]。但柴胡屬作為傘形科最大的屬，其品種繁多，文獻(xiàn)記載表明[2-4]市場(chǎng)流通的商品柴胡竟達(dá)12種之多，依次為北柴胡、狹葉柴胡、膜緣柴胡、錐葉柴胡、小葉黑柴胡、黑柴胡、霧靈柴胡、銀州柴胡、秦嶺柴胡、興安柴胡等，可見(jiàn)各地藥用柴胡的品種非?；靵y，且野生柴胡資源正在減少，市場(chǎng)需求又在不斷擴(kuò)大，因此，迫切需要開展野生道地柴胡的種質(zhì)研究及良種選育工作，運(yùn)用分子技術(shù)研究種質(zhì)之間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，有助于優(yōu)良種質(zhì)的篩選及培育。

ISSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性，Inter Simple Sequence Repeat)具有快速、高效、高遺傳多樣性、高重復(fù)性、高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，其結(jié)合了RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記，Random Amplified Polymorphic DNA)及SSR(微衛(wèi)星標(biāo)記，Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，是近些年分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。Zhang L等[5]就利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)87個(gè)油桐樹樣本進(jìn)行了遺傳關(guān)系研究，結(jié)果顯示樣本呈明顯的地理分化。Medhi K等[6]應(yīng)用RAPD及ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)研究了三種花椒屬植物的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)ISSR具有較高的多態(tài)性條帶比例及較多的擴(kuò)增條帶數(shù)。Zhan Q Q等[7]利用ISSR和SSR分子標(biāo)記構(gòu)建北柴胡遺傳圖譜，構(gòu)建了包含13個(gè)連鎖群、80個(gè)位點(diǎn)的首張北柴胡遺傳圖譜，為北柴胡性狀基因定位及優(yōu)種選育奠定了基礎(chǔ)。

目前，湖北?？?、陜西、山西等地柴胡種質(zhì)ISSR親緣關(guān)系研究均有報(bào)道，但迄今未見(jiàn)北京地區(qū)柴胡種質(zhì)資源ISSR研究的報(bào)道，且歷史上北京地區(qū)燕山、太行山一帶是道地藥材“北柴胡”的主要產(chǎn)區(qū)之一，經(jīng)本草考據(jù)和產(chǎn)地調(diào)查，其原植物來(lái)源、外觀性狀和內(nèi)在質(zhì)量均優(yōu)于其它[8]，因此，北京地區(qū)柴胡優(yōu)良種質(zhì)篩選與研究顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)以北京產(chǎn)道地柴胡為材料，通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)比考察柴胡種內(nèi)及種間的親緣關(guān)系，為北京地區(qū)柴胡優(yōu)良種質(zhì)篩選及種苗繁育奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Veriti PCR儀(美國(guó)ABI)，DYY-6D電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠)，離心機(jī)(美國(guó)，scilogex)，紫外凝膠成像分析儀(法國(guó)，VILBER LOURMAT)，MM400混合型球磨儀(德國(guó)，Retsch)，微量移液器(德國(guó)，BRAND)。

1.2 試劑

DNA提取所用試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶(Takara)，100 bp DNA Ladder(NEB)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用柴胡樣品共計(jì)15份(表1)，所有樣品均于2014年6～9月采收于北京房山、延慶、門頭溝等京郊山區(qū)。樣品由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授和首都醫(yī)科大學(xué)劉長(zhǎng)利副教授鑒定。各產(chǎn)地樣品分別取其幼嫩無(wú)蟲害的葉片，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)材料及來(lái)源

2 試驗(yàn)方法

2.1 基因組DNA提取

取植物新鮮葉片約30 mg，液氮研磨成粉末，利用植物基因組提取試劑盒提取樣本的總DNA。提取的DNA于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)10 min，以2000 bp DNA Marker 為分子標(biāo)記，在凝膠掃描儀下觀察并拍照。

2.2 ISSR-PCR

實(shí)驗(yàn)中ISSR-PCR 反應(yīng)體系為：25 μL反應(yīng)體系：含有10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)2.5 μL，dNTP mix(2.5 mmol·L-1)3.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，引物(10 pmol·μL-1)1.5 μL，DNA模板2.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，52 ℃(因引物不同而異[9])45 s，72 ℃ 2 min，45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。以ddH2O為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)(電壓83 V，120 min)在凝膠掃描儀下觀察并拍照(見(jiàn)圖1)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)產(chǎn)生了多態(tài)性擴(kuò)增的電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)各樣品的電泳條帶，按相同遷移位置上有擴(kuò)增條帶(不論強(qiáng)弱)計(jì)為1，無(wú)帶計(jì)為 0，得到全部樣品的ISSR圖譜的0/1數(shù)據(jù)矩陣，用NTSYS2.10軟件計(jì)算個(gè)體間的相似系數(shù)，進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類系統(tǒng)樹狀圖。

M為100 bp DNA ladder，1～15為材料編號(hào)同表1，0為陰性對(duì)照?qǐng)D1 引物808 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 引物篩選

利用4個(gè)樣本對(duì)43條加拿大British Columbia大學(xué)提供的ISSR引物進(jìn)行篩選，共初步篩選出15條可擴(kuò)增出3條以上電泳條帶的引物作為實(shí)驗(yàn)有效引物，再利用全部樣本進(jìn)行復(fù)篩，最終，確定8條有效引物(見(jiàn)表2)。

表2 有效引物及其擴(kuò)增結(jié)果

3.2 野生柴胡ISSR遺傳多樣性

從初篩的15條引物中篩選出8條多態(tài)性好、條帶清晰的引物，用于15個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本的PCR擴(kuò)增，大部分?jǐn)U增片段大小在100～1500 bp。表2表明，8條引物共擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)114個(gè)，每個(gè)引物擴(kuò)增位點(diǎn)為14～20個(gè)，平均16.25個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)8～18個(gè)，平均14.25個(gè)，多態(tài)性比率為87.7%。這說(shuō)明供試樣本存在較大的遺傳變異。

3.3 遺傳相似系數(shù)

遺傳相似系數(shù)是評(píng)價(jià)物種及居群間親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，其值越大，說(shuō)明親緣關(guān)系越近，反之，則越小。15份北京野生柴胡的樣本之間相似系數(shù)在0.571～0.813之間(見(jiàn)表3)，其中，來(lái)自房山區(qū)將軍坨的4號(hào)北柴胡樣本與延慶松山自然保護(hù)區(qū)的10號(hào)北柴胡樣本親緣關(guān)系最近，相似系數(shù)為0.813。而北京市房山區(qū)百草畔山頂草甸的3號(hào)霧靈柴胡樣品則與房山區(qū)蒲洼鄉(xiāng)富合村的5號(hào)北柴胡樣本親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.571。說(shuō)明同一物種生活在相近環(huán)境中，親緣關(guān)系較近，不同物種生活在不同生態(tài)環(huán)境中，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。且15份樣本均采自北京各郊區(qū)，地理位置較近，所以樣本親緣關(guān)系大都較近，而由于品種、生活環(huán)境或基因交流等原因致使一些樣本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 ISSR標(biāo)記15份樣本之間的相似系數(shù)和遺傳距離

注：下三角為相似系數(shù)，上三角為遺傳距離。

3.4 北京地區(qū)野生柴胡聚類分析

利用ISSR標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算15份野生柴胡間的遺傳相似系數(shù)，并采用UPGMA法構(gòu)建了北京地區(qū)野生柴胡的遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)，顯示實(shí)驗(yàn)樣本可分為兩大組，第一組共14份樣品，包括除5號(hào)樣品的所有樣品，并分為二個(gè)亞類，第一亞類包括1號(hào)來(lái)自房山區(qū)六合，4號(hào)來(lái)自房山將軍坨，10號(hào)、11號(hào)來(lái)自延慶松山，12號(hào)來(lái)自平谷區(qū)鎮(zhèn)羅營(yíng)鎮(zhèn)，6號(hào)、8號(hào)、7號(hào)來(lái)自門頭溝區(qū)百花山，9號(hào)來(lái)自海淀區(qū)西山森林公園，3號(hào)來(lái)自房山百草畔。第二亞類包括來(lái)自房山區(qū)十渡孤山寨的2號(hào)樣品，來(lái)自平谷區(qū)大華山鎮(zhèn)與王辛莊鎮(zhèn)的13、14號(hào)樣品，以及來(lái)自密云霧靈山的15號(hào)樣本。而第二組則只有來(lái)自房山區(qū)蒲洼鄉(xiāng)富合村的5號(hào)樣本。

圖2 15份北京野生柴胡聚類圖

4 討論

葛亞瑩等[10]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)41個(gè)麗穗鳳梨品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，12條引物共擴(kuò)增出132個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)125個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)94.70%，表明ISSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)性檢測(cè)水平。劉君等[11]則對(duì)9種狗牙根進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果顯示ISSR可有效揭示9種狗牙根的親緣關(guān)系并可用于構(gòu)建指紋圖譜。Feicui Zhao等[12]利用RAPD和ISSR技術(shù)研究烏頭屬4種植物的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)兩種方法均適用于烏頭屬植物的分析，但其中ISSR更具有較高的多態(tài)性。Jun Liu等[13]則利用ISSR及SRAP(相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，Sequence-Related Amplified Polymorphism)兩種方法分析89份香菇植株的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種標(biāo)記都能揭示材料間較高的遺傳多樣性，而且ISSR標(biāo)記的多態(tài)性又高于SRAP標(biāo)記。研究表明ISSR是一種有效的揭示品種間遺傳多樣性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)中利用8條引物，擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)114個(gè)，每個(gè)引物平均擴(kuò)增位點(diǎn)16.25個(gè)，多態(tài)性比率為87.7%，表明北京地區(qū)柴胡種質(zhì)資源存在較大的遺傳變異，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為北京地區(qū)野生柴胡種質(zhì)親緣關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。

Xu L等[14]利用ISSR和SP-SRAP(單引物相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，Single Primer-Sequence Related Amplification Polymorphism)研究100份黑粉菌的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)生態(tài)環(huán)境的特異性質(zhì)在樣品分化過(guò)程中起到了重要的作用。Yu J等[15]研究15個(gè)居群的長(zhǎng)芒草的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其與地理距離有很大關(guān)系，并認(rèn)為ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可有效可靠地評(píng)價(jià)長(zhǎng)芒草的遺傳多樣性。盧萍等[16]則利用ISSR技術(shù)研究了6個(gè)種群的小花棘豆的遺傳多樣性，聚類結(jié)果表明，生態(tài)地理?xiàng)l件相近的種群會(huì)優(yōu)先聚集。遺傳聚類結(jié)果顯示，部分結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)均來(lái)源于門頭溝百花山，9號(hào)采自海淀區(qū)西山森林公園，其生長(zhǎng)環(huán)境與百花山山腳環(huán)境相類似，所以顯示出較近的親緣關(guān)系，13、14、15號(hào)樣品均來(lái)源于北京平谷區(qū)、密云區(qū)，也具有較高的相似性，表明生態(tài)環(huán)境相近的聚為一類。

房山百草畔的3號(hào)霧靈柴胡樣本與延慶松山的11號(hào)北柴胡樣本聚在一起，其原因可能由于柴胡雌雄蕊異熟的特性導(dǎo)致其異交授粉為主的繁殖方式，一定程度上促進(jìn)了居群間基因交流，進(jìn)而出現(xiàn)基因漸滲現(xiàn)象，使得柴胡屬植物的鑒定存在困難，以此，采用多種遺傳分子標(biāo)記方法與傳統(tǒng)性狀鑒定相結(jié)合的方法確定植物基源更為可靠。此外，來(lái)源于房山區(qū)蒲洼鄉(xiāng)富合村的5號(hào)樣本則可能是采集地地勢(shì)相對(duì)較高，且地處偏僻的山區(qū)，基因交流相對(duì)較少，所以自成一支。

由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，人們對(duì)于野生柴胡資源的亂采濫挖現(xiàn)象日益嚴(yán)重，從而使得野生柴胡資源遭到嚴(yán)重破壞，藥用資源得不到保障。另外，各地藥用柴胡來(lái)源的復(fù)雜性造成了柴胡質(zhì)量的不穩(wěn)定性，以至于臨床療效受到嚴(yán)重影響?；谝陨蠁?wèn)題，開展柴胡藥材的質(zhì)量研究及人工栽培優(yōu)良種質(zhì)篩選尤為重要，而ISSR分子標(biāo)記技術(shù)則能很好的揭示品種間的親緣關(guān)系，并為栽培品種的選育奠定基礎(chǔ)。賈金萍等[17]通過(guò)對(duì)北柴胡樣本的皂苷含量、指紋圖譜及AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，Amplified Fragment Length Polymorphism)分子標(biāo)記研究，認(rèn)為柴胡的化學(xué)表型差異與其遺傳差異具有一定的相關(guān)性，且AFLP分子標(biāo)記法可有效區(qū)分不同的柴胡種群。而也有學(xué)者[18]表示皂苷含量較高且遺傳多樣性豐富的種質(zhì)資源更具有推廣的價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，皂苷含量較高的西山森林公園的9號(hào)樣本(課題組已測(cè)定)與門頭溝百花山的7號(hào)、8號(hào)樣本親緣關(guān)系較近(見(jiàn)表3)，初步認(rèn)為百花山山腳與山腰的柴胡種質(zhì)遺傳多樣性較好，值得推廣種植。此外，柴胡屬植物由于基因漸滲出現(xiàn)的資源混亂的復(fù)雜問(wèn)題，則可利用ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)藥材進(jìn)行親緣關(guān)系研究，并與形態(tài)鑒定結(jié)合的方式進(jìn)行鑒定，使得結(jié)果更加可靠，進(jìn)而提高用藥效果。

5 結(jié)論

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)北京地區(qū)野生柴胡的親緣關(guān)系研究中，15份樣本擴(kuò)增出130條條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)114個(gè)，每個(gè)引物平均擴(kuò)增位點(diǎn)16.25個(gè)，相似系數(shù)在0.571～0.813之間，表明北京地區(qū)野生柴胡具有較高的遺傳多樣性，并同時(shí)存在一定的種內(nèi)遺傳變異。而利用UPGMA聚類分析，則將15份材料進(jìn)行分類，聚類結(jié)果呈現(xiàn)出一定的地域性分布趨勢(shì)。綜上，北京地區(qū)野生柴胡應(yīng)加以保護(hù)，初步認(rèn)為百花山山腰及山腳柴胡值得推廣種植，研究為今后開展北京地區(qū)柴胡種質(zhì)親緣性研究及栽培品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

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ISSRResearchonGermplasmofBupleurumchinenseDC.inBeijing

ZHAOXiangyan，LIUChangli*,XUEWenfeng，ZHANGXianan,LUORong

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，BeijingKeyLabofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch，Beijing100069，China)

Objective：To assess population genetic diversity of different kinds of individuals ofBupleurumchinensein Beijing area by inter simple sequence repeat (ISSR) technique.Methods：Eight appropriate ones were selected from a total of forty-three primers for ISSR PCR amplification to analyse theBupleurumin Beijing area and draw dendrograms by using genetic distance UPGMA method.Results：A total of 130 bands and 114 polymorphic bands were amplified by 8 primers，the polymorphic loci accounted for 87.7%.The cluster analysis showed that genetic diversity was high inBupleurum， the intraspecific genetic variation was obvious.Conclusion：The distribution ofBupleurumgermplasm in Beijing exhibited a certain regional characteristics.It is imperative to strengthen the protection ofBupleurumwild resources.The plants in the foot and hillside of Baihuashan is good for cultivating.This study laid a foundation for the research of relationship betweenBupleurumand the breeding of cultivars.

Bupleurum；ISSR；Beijing area；germplasm；genetic relationship

2015-07-01)

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(6142002)；首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)(14ZY04)

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劉長(zhǎng)利，副教授，研究方向：中藥材規(guī)范化生產(chǎn)及其藥材質(zhì)量調(diào)控研究；Tel：(010)83911633，E-mail：lcl74@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.004