徐煒　郎濤

摘要： 熒光顯微鏡是常用的醫(yī)用光學(xué)儀器之一，分布在各大醫(yī)院科研、病理、檢驗(yàn)等部門。光源是熒光顯微鏡的主要組成部分，使用新型的LED光源替代傳統(tǒng)的高壓汞燈，以及把數(shù)碼相機(jī)改為CCD攝像裝置，使現(xiàn)有的熒光顯微鏡上了一個(gè)等級(jí)，達(dá)到現(xiàn)代熒光顯微鏡的水平。

關(guān)鍵詞： 熒光顯微鏡； 高壓汞燈； LED光源； CCD攝像裝置

中圖分類號(hào)： TH 742.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2015.04.017

Abstract： The fluorescence microscope is one of the most universal medical optical instruments and is widely applied in the scientific research， pathology and examination in the hospitals. Light source is an essential component of the fluorescence microscope. This paper explains how to use the LED as the light source of the fluorescence microscope instead of the traditional high-pressure mercury lamp and the way of transforming digital cameras into CCD imaging device， such that the existing fluorescence microscope has been greatly improved and reach to a state-of-the-art level of modern fluorescence microscope.

Keywords： the fluorescence microscope； the high-pressure mercury lamp； LED light source； CCD imaging device

引 言

LED（light-emitting diode）發(fā)光二極管是一種能將電能轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光的固態(tài)半導(dǎo)體器件。由于LED這種新型照明光源既節(jié)能又環(huán)保，被認(rèn)為“白熾燈照亮20世紀(jì)，LED將照亮21世紀(jì)”，也因此發(fā)現(xiàn)藍(lán)光LED的3人獲得2014年諾貝爾物理獎(jiǎng)。國(guó)外很快把LED這種新型光源應(yīng)用到新研制的熒光顯微鏡中，但這種產(chǎn)品價(jià)格昂貴，極少有醫(yī)院購(gòu)買。目前大量使用的熒光顯微鏡都是采用老式的汞燈，為了克服汞燈照明的缺點(diǎn)，本文根據(jù)醫(yī)院工作的需要，通過(guò)反復(fù)實(shí)踐和改進(jìn)，把LED新型光源應(yīng)用到現(xiàn)有的熒光顯微鏡中，并取得了滿意的結(jié)果。同時(shí)也將CCD（charge-coupled device）攝像裝置應(yīng)用到現(xiàn)有的熒光顯微鏡中，大大擴(kuò)展了熒光顯微鏡的功能。

在十二五期間，醫(yī)院獲得很多國(guó)家級(jí)課題和省部級(jí)課題。這些課題離不開(kāi)顯微鏡的使用，而實(shí)際情況是大多數(shù)顯微鏡功能老化，跟不上國(guó)外醫(yī)用光學(xué)儀器的發(fā)展，同時(shí)存在著以下幾個(gè)問(wèn)題：（1） 顯微鏡視場(chǎng)不清晰； （2） 顯微鏡照明功能障礙，照明不均勻； （3） 觀察細(xì)胞的光線太弱； （4） 視場(chǎng)切割。因此，必須對(duì)在用的儀器進(jìn)行改造，使顯微鏡功能可靠和操作簡(jiǎn)化。經(jīng)過(guò)顯微鏡性能測(cè)試，本文選擇對(duì)正置熒光顯微鏡進(jìn)行改造。

1 熒光顯微鏡工作原理

熒光顯微鏡是醫(yī)院科研、病理、檢驗(yàn)等部門常用的醫(yī)用光學(xué)儀器之一。因?yàn)槠胀ǖ娘@微鏡是在明亮的背景上觀察暗物，而熒光顯微鏡是在暗背景下觀察彩色的圖像，因此它比普通的顯微鏡分辨力提高100倍，可以觀察到普通顯微鏡看不到的細(xì)節(jié)[1]。但是它的調(diào)整，校正難度較高，只要解決了熒光顯微鏡的問(wèn)題，其它顯微鏡問(wèn)題就迎刃而解。

圖1是透射式熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)圖。由汞燈發(fā)出的各種譜線的光線，經(jīng)激發(fā)濾光片后只讓某一種波長(zhǎng)的紫外光線通過(guò)，如波長(zhǎng)為404.7 nm藍(lán)紫光，經(jīng)反光鏡后，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。激發(fā)濾光片將其他波長(zhǎng)的光線濾掉，并使樣品激發(fā)熒光，所以稱其為激發(fā)濾光片。通常，激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)比激發(fā)樣品的光的波長(zhǎng)大得多，是可見(jiàn)光。這樣產(chǎn)生的熒光和透過(guò)樣品的一部分激發(fā)光（紫外光），經(jīng)物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進(jìn)入目鏡視場(chǎng)，降低圖像襯度和損傷人眼，放置了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長(zhǎng)的譜線通過(guò)，如只讓 500～750 nm的可見(jiàn)光通過(guò)，而不讓500 nm以下的光通過(guò)。

從圖中可以看出，光源是熒光顯微鏡主要組成部分，以前熒光顯微鏡都采用200 W的超高壓汞燈作光源，它是由石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充有一定量的汞，工作時(shí)在兩極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過(guò)程一般約5～15 min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子在不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此被熒光顯微鏡普遍采用。汞燈的發(fā)射光譜如圖2所示。

2 高壓汞燈使用簡(jiǎn)介

高壓汞燈調(diào)整非常復(fù)雜，調(diào)整步驟如下[2]。

（1） 開(kāi)啟汞燈后，在顯微鏡工作臺(tái)上放1張白紙，并從物鏡轉(zhuǎn)換器中轉(zhuǎn)出物鏡，即轉(zhuǎn)換器上出現(xiàn)的空孔位于光軸上，卸去轉(zhuǎn)換器上保護(hù)蓋（如無(wú)空孔，可卸掉1個(gè)低倍物鏡，校正完畢后再旋上）。拉（或轉(zhuǎn)）動(dòng)顯微鏡主體內(nèi)的濾光片座，選用透過(guò)綠光的濾光片組，使反射照明有光通過(guò)物鏡轉(zhuǎn)換器孔，此時(shí)在白紙上可看到汞燈照亮的光斑。如光斑太亮，如圖3（a）可以插入中性濾光片，或戴上太陽(yáng)眼鏡，以保護(hù)眼鏡。

（2） 轉(zhuǎn)動(dòng)聚光鏡調(diào)焦旋手3，見(jiàn)圖4，使汞燈光弧在白紙上成像清晰，因汞燈室內(nèi)裝有1個(gè)用來(lái)增加亮度的球面反光鏡，于是在白紙上看到2個(gè)光弧的像，見(jiàn)圖3（a）。旋轉(zhuǎn)2個(gè)汞燈調(diào)節(jié)旋手4、8和2個(gè)反光鏡位置調(diào)節(jié)旋手5、7，使2個(gè)光弧并立，見(jiàn)圖3（b），再轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡聚焦調(diào)節(jié)旋手6，使2個(gè)光弧有接近相等的亮度，見(jiàn)圖3（c）。

（3） 旋轉(zhuǎn)2個(gè)汞燈調(diào)節(jié)旋手4、8和2個(gè)反光鏡位置調(diào)節(jié)旋手5、7，使2個(gè)光弧重合，再調(diào)節(jié)聚光鏡調(diào)焦旋手3，得到放大并且均勻的光弧像，見(jiàn)圖3（d），這樣汞燈校正工作就完成了。轉(zhuǎn)入物鏡后，根據(jù)物鏡具體倍率，稍微調(diào)節(jié)一下聚光鏡調(diào)焦旋手3就可以了。

從開(kāi)始調(diào)整到結(jié)束要1 h左右，這對(duì)非專業(yè)人員是很難完成的，所以，更換一個(gè)燈就要請(qǐng)專業(yè)公司人員來(lái)重新調(diào)整一次，這樣工作量很大，影響科研工作的進(jìn)度?？傊褂酶邏汗療糇鞴庠?，除了調(diào)整復(fù)雜外，還具有易損耗、視場(chǎng)不清晰、照明不均勻等缺陷。

3 LED的使用及其特點(diǎn)

3.1 LED和汞燈對(duì)比

（1） 汞燈是會(huì)發(fā)射出對(duì)人體有害的紫外波長(zhǎng)的光，而LED光源發(fā)射特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，能夠有效地激發(fā)樣品，不存在紫外幅射，能有效確保使用安全。

（2） 汞燈壽命一般為200～400 h，而LED使用壽命達(dá)到50 000 h，比傳統(tǒng)的汞燈提高100倍，極大延長(zhǎng)了使用壽命，降低了成本。LED因輸出強(qiáng)度高，波長(zhǎng)穩(wěn)定好，能確保激發(fā)有效性。

（3） 汞燈開(kāi)關(guān)一般要預(yù)熱30 min，而LED光源為實(shí)時(shí)開(kāi)關(guān)，不需要預(yù)熱和冷卻。

（4） 汞燈光源一般帯一個(gè)穩(wěn)壓器，占有相當(dāng)大體積，而LED光源安全性髙，體積小，可隨意搬動(dòng)，不存在汞泄漏污染和發(fā)燙問(wèn)題。

（5） 汞燈在安裝時(shí)，需要調(diào)節(jié)光源中心，換另一汞燈也需要重新校正光路，而用LED不需要光路調(diào)節(jié)。

（6） 汞燈光源亮度是一定的，要通過(guò)減光玻璃來(lái)減弱其強(qiáng)度，而LED光源則可通過(guò)旋紐來(lái)調(diào)節(jié)亮度。

（7） 汞燈100～200 W，發(fā)熱量大，需要激發(fā)電源，而LED光源可選配、移動(dòng)，這樣突然停電不會(huì)影響使用。

由于使用了LED光源，使儀器具有更多優(yōu)點(diǎn)[3]，因此應(yīng)該把新型LED光源用到熒光顯微鏡中來(lái)。

3.2 LED選型和國(guó)內(nèi)外對(duì)比

國(guó)內(nèi)外LED的主要參數(shù)，如表1所示。

從表對(duì)比知，顯然是歐美的發(fā)光效率高些。由于目前國(guó)內(nèi)LED的功率只有5 W，現(xiàn)選用德國(guó)LEICA公司的產(chǎn)品，功率為10 W，亮度可調(diào)。由于價(jià)格比較貴，今后發(fā)展的方向還應(yīng)采用國(guó)內(nèi)的LED，以降低成本。

3.3 LED的結(jié)構(gòu)

用于顯微鏡中的LED外型如圖5所示。

原儀器帶有2種波長(zhǎng)的激發(fā)濾光片：1 號(hào)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)為510～550 nm；2 號(hào)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)為460～490 nm。

為此，配置了 Leica SFL100 型的波長(zhǎng)為530 nm和470 nm的2個(gè)LED光源[4]，如圖5中1，它有上下2個(gè)。分別用2個(gè)交換式電源供應(yīng)器2供電，通過(guò)電源插頭4插入 LED光源，插到底，并用螺母5拼緊。

這種根據(jù)不同的波長(zhǎng)，采用磁性定位結(jié)構(gòu)8替代彈性片定位結(jié)構(gòu)的LED切換機(jī)構(gòu)，克服了彈性片容易變形，定位不明顯的缺點(diǎn)，目前在國(guó)內(nèi)還沒(méi)有見(jiàn)到，這也是在技術(shù)上的一種創(chuàng)新。

4 CCD攝像裝置的使用

CCD是一種半導(dǎo)體成像器件，具有靈敏度高、抗強(qiáng)光、體積小、畸變小、壽命長(zhǎng)、抗震動(dòng)等優(yōu)點(diǎn)，所以本文又在原有的儀器上，把數(shù)碼相機(jī)改成CCD攝像裝置，如圖6所示。

在原有的熒光顯微鏡1上的數(shù)碼相機(jī)接口2上，安裝成像物鏡3，通過(guò)物鏡3成像到CCD 4上，通過(guò)圖像卡5把CCD接受的信號(hào)傳到計(jì)算機(jī)7里，在計(jì)算機(jī)顯示屏上得到要觀察的圖像。軟件6用于圖像的歸檔、保存和對(duì)圖像的亮度、襯度、顏色等進(jìn)行調(diào)整。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)，中繼物鏡必須要有調(diào)焦機(jī)構(gòu)，以保證目鏡成像和計(jì)算機(jī)屏幕同時(shí)清晰。

圖7是改制的CCD攝像裝置照片，是在原儀器上安裝了Leica DFC295攝像裝置，代替了原儀器的數(shù)碼相機(jī)，這是本儀器上第2個(gè)改制。本攝像裝置能通過(guò)計(jì)算機(jī)的軟件，把300萬(wàn)像素?cái)U(kuò)展到700萬(wàn)像素，所以性價(jià)比很高。

5 結(jié) 論

由于采用了LED新光源，這次改制后視場(chǎng)清晰度達(dá)到80%，視場(chǎng)均勻性幾乎達(dá)到90%，分辨率也有很大提高，并在我院普外、腫瘤等6個(gè)學(xué)科和17個(gè)自然科學(xué)基金項(xiàng)目中得到了應(yīng)用。圖8是儀器改造后所拍攝的熒光試樣照片。

近年來(lái)，世界上一些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家圍繞LED的研制展開(kāi)了技術(shù)競(jìng)賽，如日本“21世紀(jì)光計(jì)劃”，美國(guó)“下一代照明計(jì)劃”，歐盟“彩虹計(jì)劃”。我國(guó)目前LED產(chǎn)品還屬于中、低端的產(chǎn)品，通過(guò)本文介紹，如果各大醫(yī)院能夠把現(xiàn)有的熒光顯微鏡都進(jìn)行這樣的改制，不但能節(jié)省大量的外匯，而且也會(huì)推動(dòng)LED工業(yè)的發(fā)展，為振興民族工業(yè)發(fā)揮更大的作用。

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[4] LEICA MICROSYSTEMS .Fluorescence microscopy in a new light with modern LED illumination[EB/OL].[2008-07-01].http//www.leica-microsystems.com.

（編輯：劉鐵英）