張圣方，趙龍玉，趙鳳春，王雪，楊正友*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，山東泰安271018）

泰山蛹蟲草多糖對免疫抑制小鼠腸道菌群及分泌型免疫球蛋白A的影響

張圣方，趙龍玉，趙鳳春，王雪，楊正友*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，山東泰安271018）

目的：研究泰山蛹蟲草多糖對免疫抑制小鼠腸道菌群和腸黏膜分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）的影響。方法：將60只雄性昆明小鼠隨機平均分為5組，空白對照組和環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CY）模型組的小鼠灌胃蒸餾水，3個蛹蟲草多糖組分別以100、200、300mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計，下同）劑量的泰山蛹蟲草多糖灌胃小鼠19d。第20天，空白對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余4組小鼠均腹腔注射100mg/kg的CY。觀察蛹蟲草多糖對小鼠腸道菌群和腸黏膜sIgA水平的影響。結(jié)果：與CY模型組比較，3個蛹蟲草多糖組小鼠腸道的雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量均極顯著增加（P＜0.01），而大腸桿菌、腸球菌數(shù)量均顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；3個蛹蟲草多糖組小鼠的腸道sIgA含量均極顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論：泰山蛹蟲草多糖對CY所致的免疫抑制小鼠腸道菌群紊亂有拮抗作用；泰山蛹蟲草多糖也能促進腸黏膜sIgA的分泌，在一定程度上拮抗CY所致的腸黏膜免疫抑制。

泰山蛹蟲草；多糖；環(huán)磷酰胺；免疫抑制小鼠；腸道菌群；分泌型免疫球蛋白A

泰山蛹蟲草（Cordyceps taishanensis）是一種自然野生蛹蟲草，隸屬子囊菌門（Ascomycota）、核菌綱（Pyrenomycetes）、麥角菌目（Clavioipitales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps）中的子囊真菌［1］。

蛹蟲草多糖是從蛹蟲草子實體或菌絲體中提取的具有多種生物學(xué)和免疫學(xué)活性的真菌多糖。它具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等功能，近年來引起人們的廣泛關(guān)注［2-11］。研究發(fā)現(xiàn)一些中藥多糖有改善動物腸道微生態(tài)的作用［12-15］。但是蛹蟲草多糖對腸道微生態(tài)是否具有調(diào)節(jié)作用、是否會改善腸道黏膜免疫功能，目前仍無相關(guān)文獻報道。

分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）是機體內(nèi)分泌量最多的以及腸黏膜表面主要的免疫球蛋白，對腸道黏膜防御起著重要作用。以sIgA為主的體液免疫占主導(dǎo)地位，是防御病原菌在腸道黏膜黏附和定殖的第一道防線［16］。環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CY）是目前應(yīng)用的免疫抑制劑中作用最強的藥物之一，研究廣泛認為CY可作為免疫抑制模型的造模劑［17-20］。

本實驗在前人研究成果的基礎(chǔ)上，采用蛹蟲草高產(chǎn)栽培技術(shù)［21-22］，獲得優(yōu)質(zhì)泰山蛹蟲草子實體，從中提取并純化多糖，通過小鼠灌胃實驗，檢測小鼠腸道主要菌群數(shù)量、腸道sIgA含量的變化情況，旨在探究泰山蛹蟲草多糖對CY所致的免疫抑制小鼠腸道菌群平衡和腸黏膜免疫功能的影響，為泰山蛹蟲草多糖制劑的應(yīng)用推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

清潔級昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由泰山醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

泰山蛹蟲草菌（藥鄉(xiāng)-3）由山東省泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

BBL瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂（eosin-methylene blue，EMB）、Pfizer腸球菌選擇性瓊脂、MRS瓊脂培養(yǎng)基青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；sIgA試劑盒北京方程生物科技有限公司；注射用環(huán)磷酰胺（優(yōu)級純）江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；C-32厭氧培養(yǎng)盒日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社；BIO-RAD680伯樂酶標儀美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1泰山蛹蟲草多糖的制備

采用高效提取和純化蛹蟲草子實體多糖的方法［23-24］獲得的泰山蛹蟲草多糖（子實體多糖含量測定為5.10%）。對本實驗室栽培出的泰山蛹蟲草子實體進行水提醇沉提取粗多糖，然后先后經(jīng)過Sevag法脫蛋白、活性炭除色素、透析除小分子雜質(zhì)和Sephadex G-75柱過濾層析，最后得到泰山蛹蟲草多糖純品。

1.3.2動物分組和給藥

60只昆明小鼠隨機平均分為5組：空白對照組、CY模型組和3個不同劑量蛹蟲草多糖組。飼養(yǎng)期間小鼠自由攝食、飲水。按照表1的給藥方案每天對小鼠進行定時灌胃，每次每只小鼠灌胃相應(yīng)劑量的蛹蟲草多糖溶液或蒸餾水，連續(xù)灌胃19d；第20天，對每只小鼠腹腔注射CY或等體積的生理鹽水，24h后對所有小鼠摘眼球采血，然后頸椎脫臼處死小鼠。

表1　小鼠分組和給藥方案Table1Animal grouping and drug administration of the mice

1.3.3樣品采集與處理

1.3.3.1盲腸內(nèi)容物采集與均質(zhì)化

將小鼠固定于解剖板上，常規(guī)消毒后正中切開腹腔，找出回盲部，在距回盲部末端10cm以內(nèi)，無菌收集盲腸內(nèi)容物，置于干燥滅菌小試管中。無菌條件下稱取1g盲腸內(nèi)容物，加9mL滅菌生理鹽水，于振蕩器上振蕩15min，使盲腸內(nèi)容物均質(zhì)化。

1.3.3.2腸黏液采集與處理

取靠近回盲部的小腸段，平鋪于濾紙上，縱向剖開，輕刮去腸腔內(nèi)成形糞便，再用載玻片輕刮腸黏膜表面黏液至Eppendorf管中，用3mL0.01mol/L無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH值為7.5±0.1）反復(fù)沖洗腸腔表面后，收集于5mL無菌離心管內(nèi)，充分振蕩混勻，4℃、1000r/min離心10min，取上清液于-80℃條件下凍存待測。

1.3.3.3盲腸內(nèi)容物菌液稀釋

將滅菌生理鹽水分別裝于第2～8支干燥滅菌試管內(nèi)，每支試管9mL。從裝有盲腸內(nèi)容物溶液的第1支試管中吸取1mL移入第2支，依次稀釋至第8支，直至稀釋倍數(shù)為10-8。

1.3.3.4細菌接種

樣品稀釋度選擇：大腸桿菌（10-5、10-6、10-7），腸球菌（10-4、10-5、10-6），乳酸桿菌（10-6、10-7、10-8），雙歧桿菌（10-6、10-7、10-8）。按所選稀釋度，用移液器取適當(dāng)稀釋度的樣品100?L接種于不同的選擇性培養(yǎng)基上，進行涂布，每個稀釋度做3個平行板。

1.3.3.5細菌培養(yǎng)與計數(shù)

平板培養(yǎng)基接種后按照表2的培養(yǎng)條件對腸道主要茵群進行培養(yǎng)，用常規(guī)平板活菌計數(shù)法計數(shù)［25］。

其中厭氧菌的培養(yǎng)方法為：首先把接種過的平板放在厭氧培養(yǎng)盒中，然后將兩袋打開的AnaeroPack-Anaero-3.5L厭氧產(chǎn)氣袋和氧氣指示劑快速放在厭氧盒中（若在0.5～1h內(nèi)，氧氣指示劑由藍色變成粉紅色，說明厭氧培養(yǎng)盒中已經(jīng)是無氧環(huán)境），密封好后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d。

表2腸道主要菌群的培養(yǎng)條件Table2Culture conditions of intestinal floraflora

培養(yǎng)結(jié)束后，分別選擇適當(dāng)?shù)南♂尪?，計算出各種菌落同一稀釋度的平均菌落數(shù)a。根據(jù)下式分別計算各種菌落3種稀釋度樣品的菌落總數(shù)，結(jié)果都以對數(shù)形式表示。

1.3.4小鼠腸道內(nèi)sIgA含量的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法中的雙抗體夾心法測定小鼠腸道內(nèi)sIgA水平，操作過程按照試劑盒說明書進行：標準品的稀釋：取5個小試管，編號1～5，分別加入150?L標準品稀釋液。在1號試管中加入150?L的原倍標準品，作為1號標準品；然后取150?L1號試管中的標準品加入到2號試管中，依次稀釋到第5管，分別得到質(zhì)量濃度為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5?g/mL的標準品溶液。加樣：分別設(shè)空白孔（空白孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上的標準孔內(nèi)依次加入不同質(zhì)量濃度的標準品溶液各50?L，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40?L，然后再加待測樣品10?L（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣時將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體并甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次后拍干。加酶標試劑：每孔加入酶標試劑50?L，空白孔除外。溫育：與上述溫育步驟相同。洗滌：與上述洗滌步驟相同。顯色：每孔先加入顯色劑A50?L，再加入顯色劑B50?L，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10min。終止：每孔加終止液50?L，終止反應(yīng)（此時藍色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色）。測定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長處依序測定各孔的光密度值OD450nm。測定應(yīng)在加終止液后15min以內(nèi)進行。計算：以標準物的質(zhì)量濃度為橫坐標，OD450nm為縱坐標，繪制出標準曲線并得出直線回歸方程式，計算出樣品的實際質(zhì)量濃度。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以表示。顯著性分析采用單向方差分析，多重比較采用LSD檢驗，P＜0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1小鼠腸道菌落形態(tài)

觀察小鼠腸道4種微生物在相應(yīng)選擇培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。厭氧條件下，在MRS瓊脂培養(yǎng)基和BBL瓊脂培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)出兩種菌落，分別對兩種菌落性狀和個體形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌菌落呈圓形，乳白色，表面光滑，有突起，邊緣整齊，有光澤，不透明，菌落直徑大于雙歧桿菌；雙歧桿菌菌落呈圓形，白色或乳白色，表面光滑，邊緣整齊，有光澤。普通條件下，在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基和腸球菌選擇培養(yǎng)基上也分別培養(yǎng)出兩種菌落，其中大腸桿菌菌落呈暗紅色，帶有金屬光澤，表面光滑，邊緣整齊。腸球菌菌落呈灰白色，邊緣整齊，有光澤，在菌落周圍的培養(yǎng)基顏色加深。

2.2小鼠腸道細菌數(shù)量比較結(jié)果

表 3 各組小鼠腸道菌群定量檢測結(jié)果比較（x =12）Table 3 Comparison of intestinal flora populations in mi

表 3 各組小鼠腸道菌群定量檢測結(jié)果比較（x =12）Table 3 Comparison of intestinal flora populations in mi

注：*.與空白對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與空白對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）；#.與CY模型組相比，差異顯著（P＜0.05）；##.與CY模型組相比，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

lg（CFU/g）組別乳酸桿菌雙歧桿菌大腸桿菌腸球菌空白對照組9.5877±0.1001##10.1123±0.1075##8.4427±0.0315##7.2827±0.0244##CY模型組7.4993±0.4786**7.7490±0.0679**9.4707±0.0959**7.5353±0.0528**低劑量蛹蟲草多糖組8.5673±0.4914**##8.7263±0.0286**##8.9140±0.0455**##7.3677±0.0840#中劑量蛹蟲草多糖組9.6503±0.0693##9.9610±0.0339*##8.5340±0.0706##7.1333±0.1155*##高劑量蛹蟲草多糖組9.4987±0.0511##9.6250±0.0783**##8.5067±0.0038##7.3107±0.0636##

由表3可知，與空白對照組比較，CY模型組和低劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸道乳酸桿菌數(shù)量均極顯著減少（P＜0.01），中、高劑量蛹蟲草多糖組乳酸桿菌數(shù)量差異均不顯著（P＞0.05）；與CY模型組比較，3個不同劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸道乳酸桿菌數(shù)量均極顯著增加（P＜0.01）。

與空白對照組比較，CY模型組小鼠腸道雙歧桿菌數(shù)量極顯著減少（P＜0.01），3個不同劑量蛹蟲草多糖組雙歧桿菌數(shù)量顯著或極顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）；與CY模型組比較，3個不同劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸道雙歧桿菌數(shù)量均極顯著增加（P＜0.01）。

與空白對照組比較，CY模型組和低劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸道大腸桿菌數(shù)極顯著增加（P＜0.01），中、高劑量蛹蟲草多糖組大腸桿菌數(shù)量差異均不顯著（P＞0.05）；與CY模型組比較，3個不同劑量蛹蟲草多糖組腸道大腸桿菌菌群數(shù)量均極顯著減少（P＜0.01）。

與空白對照組比較，CY模型組小鼠腸道腸球菌數(shù)量極顯著增加（P＜0.01），中劑量蛹蟲草多糖組腸球菌數(shù)顯著降低（P＜0.05），低、高劑量蛹蟲草多糖組腸球菌數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）；與CY模型組比較，3個不同劑量蛹蟲草多糖組腸球菌數(shù)顯著或極顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3小鼠腸道sIgA含量

以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，OD450nm為縱坐標，繪制出標準曲線并得到直線回歸方程為y=0.1333x-0.0477（R2=0.9974）。

表 4 小鼠腸黏膜sIgA的含Table 4 Contents of intestinal mucosal sIgA in experimental mice

表 4 小鼠腸黏膜sIgA的含Table 4 Contents of intestinal mucosal sIgA in experimental mice

組別OD450nmsIgA質(zhì)量濃度/（?g/mL）空白對照組0.0957±0.0031##5.3780±0.1146##CY模型組0.0433±0.0025**3.4147±0.0946**低劑量蛹蟲草多糖組0.0800±0.0050**##4.7897±0.1875**##中劑量蛹蟲草多糖組0.1187±0.0031**##6.2400±0.1146**##高劑量蛹蟲草多糖組0.0747±0.0030**##4.5900±0.1145**##

由表4可知，與空白對照組比較，CY模型組和低、高劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸黏膜sIgA含量極顯著減少（P＜0.01）；而中劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸黏膜sIgA含量極顯著增加（P＜0.01）。由此可見，腸道sIgA含量并非隨著蛹蟲草多糖制劑添加量的增多而升高。其中，中劑量的蛹蟲草多糖不僅改善了CY對小鼠腸道sIgA的抑制，且使小鼠腸道sIgA含量升高，甚至高于空白對照組。與CY模型組比較，低、中、高劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸黏膜sIgA含量均極顯著升高（P＜0.01）。

3　討論

機體正常菌群在與機體保持著動態(tài)微生態(tài)平衡的同時，它們之間相互也保持著恒定的比例關(guān)系，而形成一個相互依附、相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)。這種動態(tài)平衡不僅是腸道正常菌群生存所必需的，而且對機體免疫功能的正常發(fā)揮、宿主生理功能乃至生命活動都是至關(guān)重要的，因為腸道內(nèi)一些寄生菌可為腸黏膜細胞提供某些營養(yǎng)成分，維持腸道微生態(tài)平衡，激活腸道免疫系統(tǒng)，也是組成腸道屏障功能的一部分［26］。

本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，環(huán)磷酰胺（CY）模型組小鼠腸道中的雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)降低，大腸桿菌、腸球菌數(shù)量增加，均具有極顯著差異，表明腹腔注射CY造成了小鼠腸道菌群紊亂。雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量銳減，使腸道定殖抗力下降，降低了腸黏膜屏障功能。與CY模型組比較，3個劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌菌群數(shù)量有明顯增加，大腸桿菌、腸球菌數(shù)量減少；與空白對照組比較，差異總體不顯著，說明泰山蛹蟲草多糖能在一定程度上拮抗甚至恢復(fù)環(huán)磷酰胺免疫抑制導(dǎo)致的腸道菌群紊亂。

sIgA是機體黏膜免疫的主要效應(yīng)因子，sIgA、杯狀上皮細胞分泌的黏液與腸上皮細胞刷狀緣表面分布的糖萼（糖衣）和堿性磷酸酶構(gòu)成機體與外界的一層屏障，阻止絕大部分外來食物中抗原致病原的侵入。本實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，CY模型組小鼠小腸黏液sIgA水平顯著降低；3個不同劑量蛹蟲草多糖組小鼠腸道sIgA水平極顯著高于CY模型組；說明泰山蛹蟲草多糖能夠促進小鼠腸黏膜sIgA的分泌量增加，在一定程度上拮抗環(huán)磷酰胺對腸道sIgA的分泌抑制作用。

多糖對腸道菌群數(shù)量和腸黏液sIgA含量的影響不是單一方面的，兩者相互促進，相互影響。蛹蟲草多糖能促進小鼠腸內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌群數(shù)量增加，減少條件性致病菌數(shù)量，能一定程度上拮抗環(huán)磷酰胺所致的菌群紊亂；同時，多糖也能促進腸黏液sIgA的分泌。而腸黏液sIgA對腸道菌群也有促進平衡作用，可以阻止外來致病菌的黏附，并成為穩(wěn)定腸道菌膜層的組成部分［27］。腸道菌群與sIgA共同發(fā)揮對腸黏膜屏障功能的上調(diào)作用。

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Effect of Cordyceps taishanensis Polysaccharide on Intestinal Microflora and Secretory Immunoglobulin A in Immunosuppressive Mice

ZHANG Shengfang，ZHAO Longyu，ZHAO Fengchun，WANG Xue，YANG Zhengyou*
（Shandong Key Laboratory of Agricultural Microbiology，College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Taian271018，China）

This study was conducted aiming to explore the effect of Cordyceps taishanensis polysaccharide on the intestinal microflora and intestinal mucosal secretory immunoglobu lin A（sIgA）in immunosuppressive mice.Sixty Kunming male mice were randomly divided into five groups including control group，cyclophosphamide（CY）model group and C. taishanensis polysaccharide treatment groups.The mice of both control and CY model groups were administrated with distilled water，and those in three treatment groups were administrated with C. taishanensis polysaccharide at doses of100，200and300mg/（kg·d），respectively，by gavage for19successive days.On the20thday，the mice from control group were intraperitoneally injected with normal saline，and those from four other groups were intraperitoneally injected with CY at a dose of100mg/（kg·d），and the effect of C. taishanensis polysaccharide on the intestinal microflora and intestinal mucosal sIgA were analyzed.Compared with the CY model group，the numbers of Bifidobacterium and Lactobacillus were significantly increased（P <0.01），the numbers of Escherichia coli and Enterococcus were significantly decreased（P <0.05or P <0.01）and the content of intestinal mucosal sIgA was significantly increased（P <0.01）in three treatment groups.These results indicated that C. taishanensis polysaccharide could regulate the disturbance of th e intestinal microflora in immunosuppressive mice induced by CY and could also antagonize CY-induced damage of intestinal mucosal immunity to a certain extent by promoting the secretion of sIgA.

Cordyceps taishanensis；polysaccharide；cyclophosphamide；immunosuppressive mice；intestinal microflora；secretory immunoglobulin A

Q507

A

1002-6630（2015）05-0148-05

10.7506/spkx1002-6630-201505028

2014-05-07

國家自然科學(xué)基金面上項目（30972050；31271873）；山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2010CM015）

張圣方（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物學(xué)。E-mail：896106694@163.com

楊正友（1971—），男，教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全及食品微生物學(xué)。E-mail：zhyou21cn@sdau.edu.cn