王永倉 許戈良 趙旭輝 魏 忠 樊 平 戴 寅 謝 釗 劉巧玉

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的原發(fā)性肝癌，是我國高發(fā)、危害極大的惡性腫瘤，目前確切的病因還不明確，多認(rèn)為其發(fā)病是多因素、多步驟的復(fù)雜過程［1］。雌激素對(duì)肝癌有抑制作用［2，3］，雌激素對(duì)肝癌生成有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與雌激素減少腫瘤微環(huán)境中炎癥因子的釋放有關(guān)［4，5］。我院進(jìn)一步研究雌激素對(duì)大鼠肝癌模型中肝癌肺轉(zhuǎn)移形成的影響及其可能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料SPF 級(jí)雌性SD 大鼠160 只，周齡5 ～6周，體質(zhì)量120 ～160 g，由安徽省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為4 組:對(duì)照組、切除卵巢組、假手術(shù)組和去卵巢后加雌激素組［給予30 μg/(kg·d)17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol，17α-EE2)］。二乙基亞硝胺、N-亞硝基嗎啉、17α-EE2 購自美國Sigma 公司。大鼠雌二醇(estradiol，E2)、17α-EE2、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、白介素6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購自美國R＆D 公司，雌激素受體α(extrogen receptor α，ERα)、磷酸化雌激素受體α(phospho-estrogen receptor alpha，P-ERα)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)和IL-6單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模 對(duì)切除卵巢組、假手術(shù)組和去卵巢后加雌激素組進(jìn)行手術(shù)處理，去卵巢后加雌激素組在術(shù)后第2 天即給予17α-EE2 直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，劑量為30 μg/(kg·d)。誘癌方法參照本課題組研究方法［6］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn) 誘癌20 周后集中處死所有大鼠，觀察各組大鼠肝癌及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后染色并鏡下觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 染色采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)各組成瘤大鼠肝癌組織中ERα、P-ERα、HGF 和IL-6 的表達(dá)［7］。

1.2.4 RT-PCR 取各組新鮮肝癌組織，用Trizol 試劑(購自美國Promage 公司)提取組織及細(xì)胞中總RNA，操作步驟按說明書進(jìn)行。引物序列及方法見先前研究［8］。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以百分比表示，統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝癌及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率大鼠在誘癌20 周后均生成腫瘤，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)各組大鼠肝癌發(fā)生率分別為64.00%、92.59%、58.62%和44.44%，切除卵巢組大鼠肝癌發(fā)生率明顯高于其他3 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.52，P ＜0.05)。解剖結(jié)合鏡檢，提示大鼠生成肝腫瘤為HCC。對(duì)照組、切除卵巢組、假手術(shù)組和去卵巢后加雌激素組肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為25.00%、60.00%、17.65%和16.67%。切除卵巢組大鼠，即去除了雌激素的保護(hù)作用后，肝癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯高于其他3 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.22，P ＜0.05)。見表1。

表1 4 組大鼠肝癌及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率比較

2.2 肝癌組織中ERα、P-ERα、HGF 和IL-6 蛋白表達(dá)水平通過免疫組織化學(xué)染色，肝癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率最高的切除卵巢組大鼠肝癌組織中ERα、P-ERα 表達(dá)陽性率最低，而HGF 和IL-6 表達(dá)陽性率最高，與其他3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.22 P ＜0.05)。見表2。

表2 肝癌組織ERα、P-ERα、HGF 和IL-6免疫組化染色陽性率(%)

2.3 肝癌組織中ERα、HGF 和IL-6 分子表達(dá)水平

進(jìn)一步用半定量RT-PCR 方法分析4 組大鼠肝癌組織中ERα、HGF 和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平，各指標(biāo)的結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果得到了互相驗(yàn)證。肝癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率最高的切除卵巢組，大鼠肝癌組織中ERα mRNA 的表達(dá)水平最低，而HGF 和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平最高，與其他3 組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.64，P ＜0.05)。見圖1、圖2。

3 討論

流行病學(xué)研究及臨床病例報(bào)道發(fā)現(xiàn)女性的肝癌發(fā)病率顯著低于男性，這引起了臨床對(duì)雌激素抗肝癌作用的關(guān)注，雌激素對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展有保護(hù)作用［9，10］，但對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移的影響研究較少。在本次實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，4組大鼠解剖學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在去除了雌激素的保護(hù)作用后，大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯增高。

國內(nèi)對(duì)于雌激素抑制肝癌遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究報(bào)道甚少，近年來對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移研究熱點(diǎn)之一是腫瘤微環(huán)境，已有研究［11］表明腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生的促炎因子促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。在腫瘤的發(fā)生階段這種作用可能并不明顯，一旦腫瘤根深蒂固后這種微環(huán)境的變化，尤其是一些炎癥因子的釋放，會(huì)改變組織的滲透壓，影響腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)代謝環(huán)境，并發(fā)揮出免疫炎性作用，促進(jìn)腫瘤新生血管生成等，從而有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［12，13］。檢測(cè)4 組大鼠肝癌組織中HGF、IL-6、ERα 表達(dá)水平，結(jié)果顯示大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率與肝癌組織中ERα 水平表達(dá)呈反比，而與HGF、IL-6表達(dá)水平成正比。表明大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率越高，肝癌組織中ERα 表達(dá)水平越低，HGF、IL-6 表達(dá)水平越高，可以設(shè)想雌激素通過作用于ERα 減少了肝癌的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率。

那么雌激素作用于ERα 后，又通過怎樣的機(jī)制去降低大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移的呢?已知HGF 是生物活性較廣泛的生長(zhǎng)因子之一，能刺激多種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂、運(yùn)動(dòng)，在組織器官修復(fù)、形態(tài)發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，而IL-6 主要由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞以及大部分腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，它在合成以及釋放之后通過IL-6 受體向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)到信號(hào)，在多種腫瘤中發(fā)揮著調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)的作用［11］。肝癌在從無到有的發(fā)展過程中逐步形成了獨(dú)特的炎癥性腫瘤組織代謝環(huán)境的生物學(xué)特征，其對(duì)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移具有重要影響［14］。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，可以推測(cè)雌激素是強(qiáng)抗氧化劑，其與肝癌細(xì)胞內(nèi)的ERα 結(jié)合使其變成P-ERα而活化，介導(dǎo)雌激素發(fā)揮一系列生理作用。其中一種作用就是作用于炎癥信號(hào)通路，減弱促炎因子(HGF、IL-6)的表達(dá)，從而改善肝腫瘤內(nèi)的炎癥微環(huán)境。由于腫瘤炎癥微環(huán)境的改善，降低了肝癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究結(jié)果提示雌激素可能通過拮抗肝癌組織炎性微環(huán)境中HGF、IL-6 的生成釋放抑制肝癌向遠(yuǎn)處組織如肺發(fā)生轉(zhuǎn)移，這為臨床上肝癌的靶向藥物治療提供了一定理論研究基礎(chǔ)，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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