于新友+李天芝+沈志強

摘要：根據(jù)GenBank公布的小鵝瘟病毒VP1基因保守序列設計了一對引物，建立了檢測小鵝瘟病毒PCR方法，并對其特異性、敏感性進行了研究。該PCR方法對小鵝瘟病毒擴增結果為陽性，對照毒株擴增結果均為陰性;對小鵝瘟病毒檢測的靈敏性為1pg總DNA量。以上結果表明，該PCR方法特異性強、敏感性高、簡便、快速，可用于小鵝瘟的早期確診和病毒鑒定。

關鍵詞：小鵝瘟病毒;PCR;檢測

中圖分類號：Q789 ? ? ?文獻標識碼：B ? ? ?文章編號：1673-1085（2015）03-0031-04

小鵝瘟（Gosling plague，GP）是由小鵝瘟病毒（Gosling plague virus，GPV）所引起的雛鵝的一種急性或亞急性敗血性傳染病。病鵝臨床表現(xiàn)為下痢、腿癱瘓、精神萎靡、食欲廢絕，主要病理學特征為小腸中后段黏膜壞死、脫落，有纖維素性滲出物凝固形成臘腸狀栓子[1]。該病主要危害3～20日齡小鵝，特別是10日齡之內(nèi)的雛鵝更易感染，發(fā)病率和死亡率高達100%，且傳播速度快，是對養(yǎng)鵝業(yè)產(chǎn)生嚴重危害的一種重要傳染病[2]。1956年我國科研工作者首先報道了小鵝瘟這種疾病[3]，此后世界上許多國家都有該病的報道。目前，GPV診斷方法有病毒的分離和鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗[4]、反向間接血凝試驗[5]、免疫酶瓊脂擴散試驗[6]和PCR方法[7]等，但是上述方法均存在不同的缺點，或檢測靈敏度低，或檢測時間長，或操作復雜。近年來，發(fā)展PCR檢測方法具有檢測速度快、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應用于動物疾病的檢測。筆者通過不斷優(yōu)化反應條件，建立了檢測小鵝瘟病毒PCR方法，為小鵝瘟的臨床診斷和流行病學調(diào)查提供了一種簡便、快速、有效的方法。

1 ?材料和方法

1.1 ?病毒株與病料 ?小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒由本實驗室保存，臨床檢測病料為2014年采自山東省各地小鵝場臨床診斷為GPV感染的小鵝的肝臟、脾臟等。

1.2 ?工具酶及試劑盒 ?pMD18-T載體、Premix Tag、DL2000 MarKer購自大連寶生物公司，AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒和小量質粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 ?PCR引物設計與合成 ?根據(jù)GenBank中登錄的GPV基因序列（AY382889），應用Primer Premier5.0軟件，設計1對特異性引物，擴增GPV的VP1基因507bp部分片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′-ATGTGAGAAAGCAAACTT-3′，下游引物：5′-CTATCTATAAAGTCCTGG-3′。

1.4 ?GPV基因組DNA的提取 ?按AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒使用說明書提取GPV的DNA，并提取其它幾種病毒的核酸。

1.5 ?GPV VP1基因的PCR反應條件的確立 ?以提取的GPV DNA作為模板，進行PCR反應，擴增VP1基因。在其它條件不變的情況下，對反應的退火溫度進行優(yōu)化，分別采用42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃等6種不同的退火溫度進行擴增;在其它條件不變的情況下，對反應的引物濃度進行優(yōu)化，分別采用0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L等6種不同引物濃度進行擴增。反應體系保持為25μl，PCR反應的條件保持不變，為95℃預變性5min，95℃ 30S、46℃ 30S，72℃ 30S ，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.6 ?PCR擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定 ?取5μl PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，紫外燈下觀察擴增結果。如果有目的條帶，則切下目的條帶，按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書操作，回收目的片段VP1。將回收后的VP1與pMD18-T連接。將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落搖菌過夜，按質粒提取試劑盒的說明書抽提培養(yǎng)菌液的質粒，用建立的PCR方法檢測質粒是否含有VP1基因。如果含有VP1基因，將提取的質粒發(fā)送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果與參照的GPV基因序列進行基因相似性分析。

1.7 ?特異性試驗 ?分別提取小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒等7種不同的病毒核酸作為模板，用已建立的PCR檢測方法進行擴增。

1.8 ?敏感性試驗 ?提取GPV基因組DNA，用儀器測定含量，然后10倍系列稀釋，使GPV基因組DNA的含量分別為10ng DNA、1ng DNA、100pg DNA、10pg DNA、1pg DNA、0.1pg DNA。分別將其作為模板，用建立的方法分別進行PCR檢測擴增，確定PCR檢測方法的敏感性。

1.9 ?重復性試驗 ?為了驗證所建立PCR檢測方法的重復性，分別提取3批小鵝瘟陽性病料、陰性病料以及6種陰性對照病毒如鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒的核酸作為模板，進行PCR擴增反應。

1.10 ?臨床樣品的檢測 ?提取臨床上送檢的25份GP疑似病料的基因組DNA作為模板，用建立的PCR檢測方法擴增檢測，并用生物學軟件分析擴增產(chǎn)物的序列。endprint

2 ?結果

2.1 ?擴增產(chǎn)物的檢測 ?用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結果在507bp出現(xiàn)目的DNA條帶，見圖1，和預期大小一致（預期大小為507bp）。

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2.2 ?特異性試驗 ?利用所設計的引物及所確定的最佳反應條件分別對小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒進行PCR擴增。結果7個毒株中只有小鵝瘟病毒能擴增出相應的片段，大小為507bp（預期507bp），而其它均未擴增出相應的片段，見圖2。說明本研究建立的方法特異性好。

2.3 ?敏感性試驗 ?用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測5μLPCR擴增產(chǎn)物，5份樣品產(chǎn)物在507bp位置均有目的條帶，與預期一致;1份樣品產(chǎn)物無擴增條帶。結果顯示，引物的檢測靈敏度可達1pg DNA，見圖3。

2.4 ?重復性試驗 ?重復性試驗結果顯示，3批不同的病料的檢測結果相同，說明建立的PCR檢測方法重復性好、可靠、穩(wěn)定。

2.5 ?擴增產(chǎn)物測序 ?測序結果如下： ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ATGTGAGAAAGCAAACTTTCCTGAATTTCAACCTCTGGGAGAAAATTATTGTGATGAACATGGGTGGTATGATTGTGCTATATGTAAAGAGTTGAAAAATGAACTTGCAGAAATTGAGCATGTGTTTGAACTTGATGATGCTGAAAATGAACAATAAAGATGACTCAAAGCAGATATGTCTACTTTTTTAGATTCTTTTGAAGAGTGGTATGAAACTGCAGCCGCCTCGTGGCGGAATCTGAAAGCTGGAGCCCCTCACCCAAAACCAAACCAGCAGACTCAGTCTGTGTCTCCAGCCAGAGAACCCGAACGAAGAGATAATAACCGGGGCTTTGTACTTCCTGGCTATAAGTATCTTGGCCCTGGTAACGGCCTTGATAAAGGGCCACCCGTTAATAAGGCGGACAGCGTCGCGCTTGAACACGACAAGGCCTACGACCAACAGCTTAAAGCGGGAGACAACCCATATATAAAATTCAATCACGCTGACCAGGACTTTATAGATA

將測序結果與參照的GPV基因序列進行基因相似性分析，其同源性為100%。

2.6 ?臨床樣品的檢測 ?用建立的方法檢測的25份GP病料中，有7份結果呈陽性。

3 ?討論

邵洪澤等[8]根據(jù)小鵝瘟病毒VP3基因設計合成一對引物，建立了用于檢測小鵝瘟病毒的PCR方法。該法每 5μl樣品中獲得陽性擴增結果中最小檢出量為2.5×10-1.58ELD50小鵝瘟病毒量。本試驗對GenBank公布的GPV基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)GPV VP1基因相對比較保守，查找出其高度保守區(qū)域，參照GenBank中登錄的GPV基因序列（AY382889），利用Primer Premier5.0設計1對引物，通過PCR擴增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測序，對測序結果與模板序列進行比對，其同源性為100%。對退火溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當退火溫度值為46℃時，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，即使相差2℃也不能獲得理想的試驗結果。對引物濃度進行優(yōu)化，在引物濃度為0.2～1.2μmol/L時不影響PCR反應的擴增效率，擴增效率相對較高的引物濃度為0.6μmol/L，增效率相對較低的引物濃度為1.2μmol/L。敏感性試驗結果顯示，引物的檢測靈敏度可以達到1pg DNA。本試驗所建立的GPV PCR檢測方法能夠擴增出507bp目的片段，而對常見的小鵝病病毒：如小鵝細小病毒、小鵝圓環(huán)病毒、鵝源鴨瘟病毒、小鵝肝炎病毒、小鵝H9亞型禽流感病毒和小鵝副粘病毒均無擴增產(chǎn)物，證明本方法具有很好的特異性。用建立的GPV PCR檢測方法，檢測20份小鵝瘟病料，檢出7份陽性病料，因此，本試驗所建立的方法為GP的流行病學調(diào)查和檢測提供了一種簡單、快速和有效的方法。

參考文獻：

[1] ?Calnek B W.禽病學[M].10版.高福，蘇敬良，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，1999：988-995.

[2] ?盤磊，李福偉，李惠敏.小鵝瘟的生物學特性研究概況[J].水禽世界，2007（2）：49-52.

[3] ?殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：165-168.

[4] ?李新華.應用斑點酶免疫吸附試驗快速診斷小鵝瘟[J].中國獸醫(yī)科技，1998，28（1）：13-18.

[5] ?徐為燕，周陽生.小鵝瘟病毒反向間接血球凝集實驗的初步報告[J].畜牧獸醫(yī)學報，1981，12（1）：23.

[6] ?秦愛建.免疫鵝瓊脂擴散實驗在小鵝瘟診斷中的應用[J].中國預防獸醫(yī)學報，1993，15（1）：30-31.

[7] ?胡桂學，逄博，高鳳山，等.小鵝瘟PCR診斷方法的建立和初步應用[J].經(jīng)濟動物學報，2003，7（2）：50-53.

[8] ?邵洪澤，李琳，毛文智，等.鵝細小病毒PCR檢測方法的建立及應用[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2009，5（30）5-9.endprint