張椿芳，王建軍，何月秋

(1.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.寧波林業(yè)局林特種苗繁育中心，浙江 寧波 315012)

香樟莖段組培快繁技術(shù)

張椿芳1，王建軍2，何月秋1

(1.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.寧波林業(yè)局林特種苗繁育中心，浙江 寧波 315012)

以多年生香樟莖段為外植體，進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)和快速繁殖試驗(yàn)。結(jié)果表明：無菌莖段接種至MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.07 mg·L-1的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，腋芽明顯萌動并伸長展葉，且萌發(fā)率為100%；在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1可形成大量叢生芽，平均有效芽數(shù)可達(dá)5.2個；在1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，叢生芽全部生根，移栽成活率可達(dá)90%。

香樟；莖段；組織培養(yǎng)；再生體系

樟樹(Cinnamomumcaphora)又名香樟，為樟科樟屬的亞熱帶常綠闊葉喬木，廣泛分布于中國、日本，同時作為園林樹種和資源樹種被引種到多個國家種植。其生長迅速，枝繁葉茂，四季常綠，葉形秀麗而又散發(fā)濃香，既是珍貴的芳香油類樹種又是城市重要的景觀和綠化樹種。同時香樟種子遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，后代可分化出多種基因型，經(jīng)過選育可形成多種新品種。目前獲得國家授權(quán)的品種‘涌金’[1]、‘霞光’系種子變異后代，具有較高的觀賞價值，但是‘涌金’、‘霞光’母株僅有1株，需要通過無性繁殖方法保持其遺傳特性并擴(kuò)大其數(shù)量。然而，扦插和嫁接繁殖方式的成活率低。普通香樟資源豐富，開展其組培研究可為變異品種的組培技術(shù)開發(fā)提供借鑒。目前國內(nèi)外對香樟組培研究取得了一定的成果，國內(nèi)一些學(xué)者分別利用香樟伐根萌條[2-3]、不同齡期的莖段[4-12]、莖尖[13]、種子[14]、離體胚[15]、幼葉[16]、嫩芽[17-20]等作為外植體進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究工作并誘導(dǎo)出完整植株；K.Nirmal Babu等[21]也報道香樟莖段組織培養(yǎng)技術(shù)的研究成果，目前雖然有不少香樟組織培養(yǎng)獲得成功的報道，但不同學(xué)者間的觀點(diǎn)還存在一定的分歧，對香樟的組培體系的建立對成年香樟組培再生體系中增殖環(huán)節(jié)出現(xiàn)落葉[3，8]、生根率不高等問題，尚需加強(qiáng)其高效組培再生體系建立的研究，為進(jìn)一步規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2014年8月于寧波市林業(yè)局種苗中心邱隘基地采集腋芽尚未萌發(fā)的多年生的香樟新梢，帶回試驗(yàn)室備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理 取香樟發(fā)育充實(shí)、半木質(zhì)化的側(cè)梢和頂梢部分，去除葉片，剪成帶有1～2個腋芽的莖段，用洗潔精清洗4～5 min，流水沖洗30 min 以上。在超凈工作臺上用75%的酒精消毒3 min，無菌水沖洗3次，再用 0.1%升汞根據(jù)莖段直徑大小消毒 8～12 min，無菌水沖洗4～5次。濾紙吸干水分，切去莖段褐化部分，接種至MS培養(yǎng)基中，選擇無菌材料進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.2 外植體誘導(dǎo)試驗(yàn) 以MS作為基本培養(yǎng)基添加不同類型的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 0.5、1.0、2.0 mg·L-1；IBA 0.05、0.07，0.1 mg·L-1。采用不同濃度的正交組合形式，以篩選出適宜的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個試驗(yàn)號接種30 個莖段，重復(fù)3 次，30 d以后觀察腋芽生長情況。

1.2.3 增殖試驗(yàn) 以MS為基本培養(yǎng)，添加6-BA 0.5、1.0、3.0 mg·L-1；NAA 0.02、0.05，0.10 mg·L-1。采用不同濃度正交組合形式，以篩選出適宜的腋芽繼代與增殖的培養(yǎng)基，每個試驗(yàn)號接種30個芽莖段，重復(fù)3次，30 d統(tǒng)計(jì)腋芽增殖與增殖形成的叢生芽的生長情況。

1.2.4 生根試驗(yàn) 選擇培養(yǎng)瓶中生長一致、莖芽高2.0 cm的幼苗進(jìn)行生根試驗(yàn)。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基添加IBA 0.05、0.07、0.1 mg·L-1，每處理接種30株試管苗，重復(fù)3次，30 d統(tǒng)計(jì)叢生芽的生根及生長情況。

1.3 培養(yǎng)條件

經(jīng)過滅菌處理后的離體材料培養(yǎng)于10 mL的試管中，得到無菌材料后接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。誘導(dǎo)、增殖的基本培養(yǎng)基為MS，白糖為30 g·L-1；生根基本培養(yǎng)基為1/2 MS，白糖為15 g·L-1。所有培養(yǎng)基pH值均為5.8，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1，光照時間為12 h·d-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

萌發(fā)率=腋芽生長外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；平均有效芽數(shù)=30 d統(tǒng)計(jì)總芽數(shù)/接種芽數(shù)(高度為1 cm以上為有效芽)；生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (SE)表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，均值比較采用單因子方差分析，不同處理方式顯著差異性采用Duncan′s新復(fù)極差測驗(yàn)方法(SSR，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腋芽萌發(fā)

多數(shù)學(xué)者[4-12]認(rèn)為6-BA與NAA組合有利于香樟腋芽誘導(dǎo)，然而前期研究表明莖段在添加NAA的培養(yǎng)基中極易產(chǎn)生愈傷組織、腋芽斷裂。在添加有適宜濃度的6-BA與IBA培養(yǎng)基中，無菌化后的莖段15 d后腋芽開始萌動、抽長并長出新葉。由表1可知，低濃度的6-BA、IBA有利于香樟腋芽的誘導(dǎo)，這與彭東輝[5]、龔崢等[19]報道的結(jié)果一致。當(dāng)6-BA>1 mg·L-1、IBA>0.1 mg·L-1時香樟莖段腋芽的誘導(dǎo)率降低、莖段切口形成愈傷組織，進(jìn)而褐化、死亡。當(dāng)6-BA為0.5 mg·L-1、IBA為0.05～0.1 mg·L-1時，香樟莖段腋芽均可全部萌發(fā)，與其他組合相比，萌芽率達(dá)到顯著水平(P<0.05)。然而IBA濃度較低則出現(xiàn)腋芽生長緩慢，而IBA>0.07 mg·L-1時萌發(fā)的腋芽出現(xiàn)新葉脫落，不利于進(jìn)一步發(fā)育。綜合分析表明，培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.07 mg·L-1較為適合香樟腋芽的啟動培養(yǎng)。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

*：不同字母為差異顯著(P<0.05，Duncan′s新復(fù)極差檢驗(yàn))。下同。

2.2 腋芽增殖

由表2可知，香樟腋芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代時叢生芽難以增殖，同時容易出現(xiàn)葉片死亡、生長勢逐漸衰弱進(jìn)而出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。而在添加不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基中，腋芽增殖形成的叢生芽可正常生長。當(dāng)NAA為0.02～0.10 mg·L-1，6-BA為0.5 mg·L-1時腋芽可大量增殖，平均有效芽數(shù)最高可達(dá)到5.2；6-BA增加到1 mg·L-1時，雖然平均有效芽數(shù)有所提高，最高可達(dá)到5.4，顯著高于6-BA為0.5 mg·L-1、3 mg·L-1時的平均有效芽數(shù)(P<0.05)，但切口基部愈傷組織增加，分化的叢芽變得細(xì)小，嚴(yán)重的出現(xiàn)葉片脫落和褐化；當(dāng)6-BA增加到3 mg·L-1時，平均有效芽數(shù)急劇下降，愈傷化嚴(yán)重，叢芽發(fā)育不良夾雜死苗，表明高外源植物生長調(diào)節(jié)劑不利于香樟叢生芽的繼代與增殖。不同培養(yǎng)基配方對腋芽增殖效果進(jìn)行分析表明，在培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1中腋芽增殖達(dá)到的平均有效芽數(shù)可達(dá)到5.2以上，且形成的叢生芽生長狀態(tài)好。因此，該培養(yǎng)基是香樟腋芽適宜的繼代與增殖培養(yǎng)基。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香樟叢生芽在增殖培養(yǎng)基中反復(fù)繼代6次以上，切口處容易形成大量白色膨松的愈傷組織，同時出現(xiàn)畸形苗和死苗，需要與無NAA的培養(yǎng)基隔代交替使用，以分化出更多生長正常的叢生芽，以保證增殖體系。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對叢生芽增殖的影響

2.3 植株再生

將生長至2 cm高的香樟叢生芽轉(zhuǎn)移至大量元素減半、添加不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的生根培養(yǎng)基中。由表3可知，培養(yǎng)基無任何植物生長調(diào)節(jié)劑時叢生芽沒有生根，生根率極低；隨著IBA濃度的增加叢生芽的生根率逐漸增加。然而當(dāng)IBA為0.1 mg·L-1及以上時，叢生芽的切口愈傷組織增多，根從愈傷組織長出，根的維管束組織與莖的維管束組織不相連，不利于生根苗的成活。同時形成的不定根大多數(shù)為5～6條，較少有側(cè)根形成(圖3、圖4)。叢生芽在1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1培養(yǎng)基中生根率、平均根數(shù)、苗高顯著高于其它生根培養(yǎng)基(P<0.05)，因此該培養(yǎng)基是香樟組培苗生根的適宜培養(yǎng)基。30 d后選擇健壯的再生植株進(jìn)行移栽。移栽前逐漸打開瓶蓋煉苗5～7 d，然后將小苗取出后，用水洗去根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽于裝有蛭石與泥碳土等比例混合的基質(zhì)的容器內(nèi)，60 d后移栽成活率為90%左右。

表3 香樟組培苗的生根培養(yǎng)

圖3 樟樹組培苗生根培養(yǎng)圖4 樟樹再生植株

3 結(jié)論與討論

目前有不少香樟組織培養(yǎng)獲得成功，多數(shù)研究者在香樟組培過程中選用的基本培養(yǎng)基為MS、改良MS、1/2 MS并按照不同的培養(yǎng)階段進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，在腋芽誘導(dǎo)和增殖階段所使用的植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度范圍為6-BA(1～2 mg·L-1)和NAA(0.05～0.5 mg·L-1)；繼代與增殖階段6-BA(3～5 mg·L-1)和IBA(0.2～0.1 mg·L-1)，對于最佳濃度組合不同學(xué)者的觀點(diǎn)存在一定的分歧[23]，這可能與外植體采集的時間、樹齡、基因型等諸多因素有關(guān)。本研究中香樟在再生體系建立過程中使用的基本培養(yǎng)基與其他學(xué)者基本一致，而使用的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度則表現(xiàn)出差異。本研究結(jié)果顯示，香樟腋芽對NAA非常敏感，低濃度即可使得切口處、葉柄與莖段連接處產(chǎn)生大量愈傷組織并且莖段過于膨大，而MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.07 mg·L-1有利于香樟腋芽誘導(dǎo)與生長；在腋芽繼代與增殖階段6-BA與IBA的組合容易導(dǎo)致腋芽的生長勢衰弱，而MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1則有利于腋芽的繼代與增殖。同時在腋芽生長與增殖過程中最常見的問題是新生嫩芽褐化且嫩葉從上到下發(fā)生壞死現(xiàn)象，這與李乾振等[3]和索長江等[13]報道的一致。李乾振等[3]和索長江等[13]在研究普通香樟組培時認(rèn)為添加NaH2PO450 mg·L-1可降低此現(xiàn)象的發(fā)生，本研究則通過調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度可以避免。整個培養(yǎng)過程表明，高濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑容易導(dǎo)致腋芽的愈傷化并明顯抑制其發(fā)育，但本試驗(yàn)中香樟叢生芽生長較慢，如何改善這一現(xiàn)狀并提高香樟組培體系的高效性尚需進(jìn)一步研究。在生根階段，叢生芽在添加有IBA 0.05 mg·L-1的培養(yǎng)基中組培苗的生根率可達(dá)到100%。

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Study on Tissue Culture and Plant Regeneration ofCinnamomumcaphora

ZHANG Chun-fang1，WANG Jian-jun2，HE Yue-qiu1

(1.NingboCityCollegeofVocationalTechnology，Ningbo315100，Zhejiang，China； 2.BreedingCenterofSpecialtyForestSeedlings，NingboForestryBureau，Ningbo315012，Zhejiang，China)

A micropropagation protocol was developed forCinnamomumcaphorausing as initial explant nodal segments from newly emerged laterals of trees.The results showed that bud inducement was initiated on a MS medium containing 0.5 mg·L-16-BA and 0.07 mg·L-1IBA.The inducement rate of valid buds reached to 100%.The shoots were subcultured and multiplied on an improved MS medium containing 0.5 mg·L-16-BA and 0.05 mg·L-1NAA and the effective bud per shoot was 5.2.Harvested shoots were rooted in vitro in 1/2 MS supplemented with 0.05 mg·L-1IBA for 30 days and the rooting rate was 100%.The survival rate was 90% when the rooting shoots were moved to the greenhouse.

Cinnamomumcaphora；nodal segments；tissue culture；plant regeneration

2014-12-11；

2015-02-25

寧波市林業(yè)科技項(xiàng)目(2011L05)；浙江省寧波市科技局農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2007C10009)

張椿芳(1977—)，女，貴州石阡人，寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，從事植物組織培養(yǎng)研究。E-mail：zhangchunfang@nbcc.cn。

何月秋。E-mail：heyueqiu@nbcc.cn。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.04.028

S723.1+32.6

A

1002-7351(2015)04-0128-05