陳英，張西英（新疆兵團第六師農業(yè)科學研究所，新疆五家渠831300）

紅顏草莓離體培養(yǎng)技術初探

陳英，張西英
（新疆兵團第六師農業(yè)科學研究所，新疆五家渠831300）

本文以紅顏草莓葉片和匍匐莖為外植體，進行無毒苗離體培養(yǎng)，通過不同滅菌和誘導處理，得出組織培養(yǎng)方法誘導草莓植株再生的適宜方案。結果表明，幼嫩葉片和匍匐莖分別采用75%酒精浸泡20s和30s后用無菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無菌水漂洗5遍后再用濾紙迅速吸干接種，獲得無菌株成功率達90%以上；葉片誘導分化適宜培養(yǎng)基為6-BA0.2mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.1mg/L；匍匐莖尖誘導分化適宜培養(yǎng)基為6-BA0.1mg/L+IBA1mg/L。

草莓；幼嫩葉片；莖尖；離體培養(yǎng)

草莓是薔薇科宿根多年生常綠草本植物，具有適應性廣，生長周期長，結果多，果實顏色鮮艷，肉質細嫩柔軟多汁，甜酸適口，風味獨特，果實營養(yǎng)豐富以及經濟價值高的特點，是人們喜愛的果品之一。在世界漿果類水果生產中，草莓的栽培面積和產量僅次于葡萄，為世界性第二大漿果水果[1]，近年來，研究進一步發(fā)現草莓含有鞣花單寧、花青素苷、天竺葵素、矢車菊素等類黃酮生物活性物質，能在很大程度上防止心腦血管、癌癥和老年神經變性等疾病的發(fā)生，草莓也因這些抗氧化活性物質所具有的獨特醫(yī)療保健功能愈加受到消費者青睞[2-4]。草莓生產中主要靠匍匐莖壓枝和分枝繁殖，在長期的生產和繁殖過程中，草莓極易感染和傳染病毒，造成多種病毒病的侵染率不斷提高[5]，病毒對草莓的危害十分嚴重，病毒導致減產可達30%～80%[6]，目前，草莓植株體內已經發(fā)現62種病毒，其中，在我國危害大，分布廣，造成損失嚴重的主要有草莓皺縮病毒、斑駁病毒、輕型黃邊病毒和鑲脈病毒[7]。這些病毒多是蚜蟲傳播，而草莓自身對病毒沒有免疫能力。病毒容易引起葉片黃化或葉緣失綠，幼葉反卷，成熟葉片產生壞死條斑或葉脈壞死、扭曲，甚至出現葉片枯死、植株矮化、老葉變紅，造成草莓長勢極弱，產量和品質嚴重下降，且草莓病毒病會隨著草莓營養(yǎng)繁殖而代代相傳。到目前為止，尚沒有特效藥或特效方法治愈草莓病毒病。

采用莖尖培養(yǎng)法進行無毒苗的培育，是目前世界上獲得草莓無毒苗最普遍且最有效的方法，采用無毒材料培養(yǎng)的秧苗無病毒，生長健壯，葉片濃綠，繁殖快，果實品質較好，產量較高。本試驗以“紅顏”品種為試材，探討以葉片、莖尖離體培養(yǎng)再生植株獲得草莓無毒苗的技術方法，不僅為建立草莓脫毒苗離體培養(yǎng)體系奠定基礎，而且也為草莓種苗脫毒和大規(guī)模生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為第六師國家科技園區(qū)溫室大棚栽培的“紅顏”草莓品種。

1.2 不同外置體處理

表1 不同外植體滅菌處理min

草莓植株毛面遍布絨毛，從田間選取生長健壯、無病蟲害、典型性狀優(yōu)良的植株為母株，剪取剛抽出的匍匐莖莖尖約3cm和幼嫩的葉片，分別用1%洗潔精水溶液浸泡5min，并用玻璃棒輕微攪動后，再用自來水沖洗30min，無菌水沖洗1遍后移入超凈工作臺。根據表1對不同外植體進行滅菌處理，將匍匐莖尖和葉片分別放入滅菌燒杯中。倒入75%酒精分別浸泡20s、30s，無菌水沖洗3次，轉入0.1%升汞溶液輕微攪動4min、5min、8min，用無菌水沖洗5次，用濾紙迅速吸干水分。各處理分別接種50個外植體，10d后統(tǒng)計外植體數量，并對外植體損傷情況進行統(tǒng)計。

1.3 誘導分化培養(yǎng)

1.3.1 葉片離體再生

將消毒后的葉片切成5mm左右小塊作為外植體，誘導培養(yǎng)基MS為基礎培養(yǎng)基，附加不同植物生長調節(jié)劑濃度配比（見表2）。

表2 葉片離體再生mg/L

每瓶放置1片外植體，放置于恒溫培養(yǎng)室，在22～25°C，光照2000-3000Lx，光照時間16h條件下進行培養(yǎng)，2周后葉片周圍出現愈傷組織，30d后有綠色芽點。

1.3.2 匍匐莖尖誘導分化

表3 匍匐莖尖誘導分化mg/L

在超凈工作臺上，40倍顯微鏡下，剝取匍匐莖尖（帶1～2個葉原基）。按照表3對匍匐莖尖誘導分化處理，每瓶接種1個莖尖外植體，接種好后放置于恒溫培養(yǎng)室，在溫度22～25°C，光照2000～3000Lx，光照時間16h條件下進行培養(yǎng)，仔細觀察生長情況發(fā)現，在1周后綠點慢慢長大，4周后出現叢生芽點。

2 結果與分析

2.1 不同外植體滅菌結果

草莓的幼嫩葉片和匍匐莖都能誘導分化，從表4可以看出，葉片采用A2處理時外植體滅菌效果好，損傷程度低。匍匐莖采用A5外植體滅菌效果好，損傷程度低。即：葉片采用75%酒精浸泡20s，用無菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無菌水漂洗5遍處理效果較好；匍匐莖采用75%酒精浸泡30s，用無菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無菌水漂洗5遍的處理效果較好。

2.2 不同外植體誘導分化結果

從表5可以看出，B1、B2、B3叢生的芽點少，誘導率低于50%，而葉片誘導分化B4芽點多，長勢良好，B6芽點也多，但B6出現幼苗有輕度的玻璃化，因此，以B4最好。

表4 不同外植體滅菌處理

表5 葉片離體再生

表6 匍匐莖尖誘導分化

從表6可以看出，C1、C2的誘導率偏低，C4、C5、C6的誘導率低于90%，C3匍匐莖誘導分化大于90%，芽點狀態(tài)較好，因此，以C3處理誘導分化效果較好。

3 小結

（1）本文研究表明，葉片采用75%酒精浸泡20s，用無菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無菌水漂洗5遍后用濾紙迅速吸干接種，成功率達到90%以上，匍匐莖采用75%酒精浸泡30s，用無菌水漂洗3遍，0.1%升汞消毒5min后用無菌水漂洗5遍后用濾紙迅速吸干接種，成功率達到93%以上。（2）細胞分裂素能促進植物體細胞的分裂以及器官誘導生長，從而對不定芽的產生獲得積極的影響，葉片誘導分化以B4最好，即葉片誘導培養(yǎng)基6-BA 0.2mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.1mg/L。匍匐莖誘導分化C3最好，即6-BA0.1mg/L+IBA1mg/L。

[1]張躍建，朱振林.大棚草莓配套栽培技術[m].上?？茖W普及出版社，2000，9.

[2]楊秀娟，趙曉燕，馬越，等.花青素研究進展[J].中國食品添加劑.2005，4：40-42.

[3]姜卓俊.山東草莓種植業(yè)發(fā)展之我見[J].科技致富向導.2010 （003）：6-7.

[4]張寧，胡宗利，陳緒清，等.植物花青素代謝途徑分析及調控模型建立[J].中國生物工程雜志.2008，28（1）：41-44.

[5]張志宏，肖敏，楊洪一，等.草莓病毒脫除方法的比較與評價.果樹學報[J].2006，23（5）：720-723.

[6]周厚成，何水濤.草莓病毒病的研究進展.果樹學報[J]. 2003，20（5）：421-426.

[7]胡淑明，張學英，李青云，等.草莓脫毒技術研究進展.河北果樹[J].2007（4）：1-2.

2015—03—23