趙宇紅 李芳芳 曾 宇 (廣東藥學院藥科學院，廣東 廣州 50006)

在抗阿爾茨海默病(AD)藥物研發(fā)策略中，以淀粉樣肽為靶的病因治療策略是最為重要藥物研發(fā)方向。但這一策略對已形成的神經(jīng)元丟失、神經(jīng)元聯(lián)系的匱乏，及由此引發(fā)記憶和認知的下降并無改善作用，因此，有助于突觸修復和改善突觸功能的治療靶點是AD發(fā)生后有效改善臨床癥狀的值得重視的研究方向〔1～3〕。突觸的可塑性是指突觸在一定條件下，其突觸的傳遞效能和突觸的結(jié)構(gòu)都可能發(fā)生變化和改變，它被公認為是學習記憶活動在細胞水平的生物學基礎(chǔ)。突觸蛋白(Syn)特異性地定位于軸突終末的突觸囊泡膜上，構(gòu)成特異性的膜通道，參與囊泡的轉(zhuǎn)運和遞質(zhì)釋放，其數(shù)量的減少表明突觸傳遞功能的下降。生長相關(guān)蛋白43(GAP43)是與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的胞膜磷酸蛋白，它磷酸化后可釋放與之結(jié)合的鈣調(diào)素，刺激微管蛋白和肌動蛋白在生長錐上的聚合抵抗其回縮，調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢的出芽，并可通過鈣調(diào)素的激活，影響離子通道和信號的傳遞，因此，這兩種突觸蛋白是反映突觸的可塑性改變的可靠指標。芹黃素屬于植物類雌激素，這類成分對AD發(fā)生的預防作用有較多的報道，但它對突觸功能的影響及機制研究較少〔4～6〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)芹黃素對淀粉樣肽引起的毒性損傷的保護作用〔7，8〕，它是否有助于突觸修復和突觸功能的改善值得進一步研究，本研究觀察了芹黃素對快速老化SAMP8小鼠學習記憶行為及改善神經(jīng)突觸聯(lián)系相關(guān)蛋白表達的影響，探討其對神經(jīng)可塑性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 6月齡雄性SAMP8及SAMR1小鼠，體重(25±5)g，由天津中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供〔許可證號:SCXK(津)2008-0001〕。對小鼠進行游泳能力測定，去除懼水及不擅游泳者〔9〕，得到SAMP8小鼠40只，隨機分為模型組、芹黃素10、20、40 mg/kg三個劑量組，每組10只，SAMR1小鼠(雄性)10只為對照組。各組小鼠自由進食和飲水，維持室溫22℃～25℃，空氣濕度55% ～58%，12 h光照，12 h黑暗。芹黃素組按上劑量以10 ml/kg腹腔注射給藥，模型組及對照組給予同量的生理鹽水，連續(xù)給藥28 d后，各組進行Morris水迷宮實驗，實驗完成后冰上斷頭處死取腦。

1.2 主要儀器及試劑 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(中山大學中山醫(yī)學院解剖學教研室提供)，Gene Amp PCR system 2700 PCR擴增儀，BIO2 RADPOWER/PAC3000電泳儀，UV24500紫外分光光度儀，UVI凝膠成像分析系統(tǒng) (Sigma，USA);總RNA抽提試劑盒 (Trizol Reagent，Gibco)，RT 試劑盒 (MBI，USA)，PCR 試劑盒 (Takara，Japan)，小鼠抗 β-actin、Syn、GAP43 一抗及二抗(Sigma-Aldrich，USA)，其他試劑均購自北京鼎國生物科技公司，芹黃素購自靜琳科工貿(mào)有限公司。

1.3 Morris水迷宮測試學習記憶能力 根據(jù)文獻方法〔9，10〕，進行定位航行實驗:平臺置于第Ⅱ象限，每天定時訓練兩次，每次時間間隔不小于4 h，每次訓練中小鼠依次，分別從第四象限置小鼠入水，記錄小鼠在60 s找到平臺并滯留2 s的時間，即為逃避潛伏期。記錄每天訓練兩次的平均值，每只小鼠共訓練10次。空間探索實驗:實驗最后1 d，撤除平臺，記錄60 s內(nèi)小鼠游經(jīng)平臺次數(shù)(尋求平臺次數(shù))及在平臺所在象限游泳時間(停留時間)。

1.4 腦組織分離、提取 根據(jù)文獻方法〔11〕，小鼠斷頭處死后，迅速分離海馬并稱重，左側(cè)海馬置于蛋白裂解液中，冰上勻漿，4℃冷凍離心機10000 r/min離心10 min，取上清液，用Bradford法定蛋白含量，－20℃保存，用于Western印跡檢測;另一側(cè)置于一步法Trizol提取液中。

1.5 Western印跡測定Syn、GAP43蛋白表達〔11〕將提取的海馬組織蛋白(100 μg)加入4×SDS緩沖液(總體積為20 μl)，100℃沸水變性3～5 min;10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳2 h;半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜35 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入小鼠抗 Syn(1∶1000，Abcam，USA)或小鼠抗 GAP43(1∶10000，Abcam，USA)4℃過夜，PBST漂洗3次 ×10 min;HRP-抗小鼠IgG(1∶5000，Abcam，USA)室溫孵育 1h，PBST 漂洗 3 次 ×10 min;膜上加ECL熒光顯影液，在暗室內(nèi)曝光;室溫顯影、定影，最后用自來水沖洗膠片。結(jié)果用Image J program(NIH)定量分析。

1.6 RT-PCR測定 Syn、GAP43 mRNA表達〔11〕參照 Trizol說明書操作，提取總RNA，測定其濃度及純度，－80℃凍存?zhèn)溆?。每個樣品取2 μg的 RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，取1 μl的 cDNA進行PCR擴增。引物由上海生物工程科技公司設(shè)計合成，Syn引物序列:5'-TTC TTC GGA ATG GAG TCA AA-3'(上游)，5'-TGC TTG TCT TCA TCC TGG TG-3'(下游)，711 bp;GAP43 引物序列:5'-CGA GAA AGA TCC CAA GTC CA-3'(上游)，5'-GAA CGG AAC ATT GCA CAC AC-3'(下游)，206 bp;內(nèi)對照 β-Actin引物序列:5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3'(上游)，:5'-TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA-3'(下游)，302 bp。PCR反應條件:94℃ 2 min;90℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃1 min，30 個循環(huán);72℃延伸5 min。各組實驗獨立重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，各組間兩兩比較用LSD檢驗，如方差不齊，各組經(jīng)秩和轉(zhuǎn)換后用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度芹黃素對SAMP8小鼠學習能力的影響 定位航行實驗結(jié)果顯示，對照組與模型組相比，逃避潛伏期在訓練第3天出現(xiàn)明顯縮短(P=0.043)，表明SAMP8小鼠在7月齡時出現(xiàn)了學習能力減退;芹黃素10、20、40 mg/kg給藥組與模型組相比，其逃避潛伏期在訓練第四天出現(xiàn)明顯縮短(P=0.041、0.034、0.036)，表明芹黃素可提高SAMP8小鼠學習能力。見表1。

表1 芹黃素對SAM小鼠逃避潛伏期的影響(s，n=10，±s)

表1 芹黃素對SAM小鼠逃避潛伏期的影響(s，n=10，±s)

與模型組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，下表同

1 d 2 d 3 d 4 d 5 d對照組 45.3±8.132.3±9.821.0±7.11) 17.3±3.52) 15.5±4.52)組別模型組 46.4±11.142.2±7.438.2±7.033.6±4.631.5±4.1芹黃素 10 mg/kg組 45.3±9.639.1±9.931.6±7.124.0±3.71) 22.0±3.42)芹黃素 20 mg/kg組 46.1±9.138.2±8.327.3±9.81) 20.4±4.01) 17.2±3.52)芹黃素 40 mg/kg組 45.6±9.236.4±9.228.3±8.122.2±4.91) 20.0±3.62)

2.2 不同濃度芹黃素對SAM小鼠空間記憶能力的影響 空間探索實驗結(jié)果顯示，SAMP1對照組與SAMP8模型組相比，尋求平臺次數(shù)明顯增多，在平臺所在象限停留時間明顯延長(P=0.007、0.006、0.006)，表明模型組與對照組小鼠相比，記憶維持能力明顯減退。芹黃素10、20、40 mg/kg劑量組與模型組相比，尋求平臺次數(shù)增多(P=0.047、0.007、0.008)及在所在平臺停留時間延長(P=0.044、0.008、0.008)，其中以 20、40 mg/kg 劑量組與模型組相比差異較明顯(P＜0.01)。表明芹黃素可提高記憶維持能力。見表2。

2.3 芹黃素對衰老小鼠海馬Syn及GAP-43蛋白表達的影響模型組與對照組相比，其Syn的蛋白表達明顯減少(P=0.004、0.005、0.004)，表明模型成功，芹黃素 10、20、40 mg/kg劑量組與模型組相比，Syn的蛋白表達均有明顯增加(P值分別為0.007、0.005、0.006);模型組與對照組相比，其GAP43蛋白表達明顯減少(P 值分別為 0.036、0.005、0.006)，芹黃素 10、20、40 mg/kg劑量組與模型組相比，GAP43的蛋白表達均有增加，其中，以20及40 mg/kg劑量組增加更為明顯(P＜0.01)。見表3。

2.4 芹黃素對衰老小鼠海馬Syn及GAP-43 mRNA表達的影響對照組與模型組相比，其Syn及GAP43的mRNA表達量明顯較多(P=0.008、0.007、0.008)，芹黃素 10、20、40 mg/kg 劑量組與模型組相比，Syn及 GAP43 mRNA表達量增加明顯(P=0.007、0.006、0.006)。見表 4。

表2 Morris水迷宮檢測芹黃素對SAM小鼠空間記憶力的影響(n=10，±s)

表2 Morris水迷宮檢測芹黃素對SAM小鼠空間記憶力的影響(n=10，±s)

組別 穿越平臺次數(shù) 第二象限停留時間(s)對照組 7.99±3.672) 15.84±5.102)模型組 3.541±2.117.42±4.54芹黃素10 mg/kg組 4.67±2.721) 9.98±3.581)芹黃素20 mg/kg組 7.55±3.952) 15.83±5.162)芹黃素40 mg/kg組 6.25±3.812) 13.11±5.422)

表3 芹黃素對SAM小鼠海馬Syn及GAP-43蛋白表達的影響(n=10，±s)

表3 芹黃素對SAM小鼠海馬Syn及GAP-43蛋白表達的影響(n=10，±s)

組別GAP43/β-actin(灰度值)P值Syn/β-actin(灰度值)P 值0.591±0.0250.0050.618±0.0490.004模型組 0.345±0.026 － 0.355±0.034 －芹黃素10 mg/kg 0.403±0.0370.0360.457±0.0320.007芹黃素20 mg/kg 0.559±0.0180.0050.577±0.0550.005芹黃素對照組40 mg/kg 0.503±0.0380.0060.516±0.0540.006

表4 芹黃素對SAM小鼠海馬Syn及GAP-43 mRNA表達的影響(n=10，±s)

表4 芹黃素對SAM小鼠海馬Syn及GAP-43 mRNA表達的影響(n=10，±s)

組別GAP43/β-actin(灰度值)P值Syn/β-actin(灰度值)P 值0.673±0.0780.0050.773±0.0760.003模型組 0.464±0.056 － 0.595±0.054 －芹黃素10 mg/kg 0.707±0.0610.0080.838±0.0270.007芹黃素20 mg/kg 0.781±0.0850.0070.892±0.0590.006芹黃素對照組40 mg/kg 0.661±0.0650.0080.855±0.0830.006

3 討論

芹黃素又稱芹菜素，屬黃酮類化合物，其化學結(jié)構(gòu)為4'，5，7-二羥黃酮，其化學結(jié)構(gòu)決定了其獨特的生物學特性和藥理學效應，研究表明芹黃素具有植物雌激素的活性，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗氧化、抗炎、自由基清除等作用〔12～14〕。前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，芹黃素具有抗氧化作用，并可減少由淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)元凋亡有〔7，8〕，對老年癡呆發(fā)生的預防有較好的應用前景，但其對這類神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元突觸重塑與再生的影響鮮見報道。

本實驗選取SAM模型小鼠作為研究對象，文獻報道6月齡以后的SAM小鼠迅速出現(xiàn)老化的病理特征，其腦內(nèi)神經(jīng)元的病理變化特征與AD的退行性神經(jīng)改變相似〔15～17〕。本實驗以學習記憶的行為學變化作為芹黃素抗AD藥效的觀察指標。Morris水迷宮實驗(MWM)是目前公認的評價認知水平的行為模式，在該實驗中形成的空間參考記憶，從其儲存機制及記憶屬性來評估屬于陳述記憶，與臨床AD患者早期突出的陳述性記憶受損相一致，因此，該方法是評價和篩選AD有效成分的恰當研究方法〔18〕。

本實驗表明芹黃素對SAMP8小鼠快速衰老引起的學習記憶障礙有明顯改善作用。

神經(jīng)系統(tǒng)的功能有賴于神經(jīng)元和靶細胞間精確突觸聯(lián)系的形成和維持，突觸部位的蛋白質(zhì)發(fā)揮著控制膜興奮性，嵌入神經(jīng)介質(zhì)受體，維持細胞內(nèi)離子穩(wěn)定，保持蛋白激酶和磷酸激酶活性等復雜而重要的調(diào)控作用〔19，20〕。突觸部位蛋白的變化與神經(jīng)元的功能密切相關(guān)。目前的研究認為，海馬神經(jīng)元是學習記憶密切相關(guān)中樞部位，其突觸結(jié)構(gòu)和功能變化是學習記憶的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)〔19〕。AD患者海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)突觸含量比正常人減少，并與AD的認知程度有關(guān)，因此，本實驗中選取海馬部位的突觸蛋白進行研究。

Syn是突觸小泡中含量最重要的膜蛋白，與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸的可塑性關(guān)系密切〔21，22〕。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠學習記憶受損后，海馬突觸素表達水平下降，敲除Syn基因的小鼠在MWM實驗中表現(xiàn)出空間學習記憶功能的損傷，而Syn高表達，則表現(xiàn)出空間學習記憶功能的改善與提高〔23〕。Haley等〔24～26〕的研究認為，在神經(jīng)突觸Syn表達水平降低可引起突觸小胞融合功能障礙或神經(jīng)的釋放障礙，這可能會干擾突觸后去極化或超極化電位的形成，并最終影響學習和記憶功能。本研究發(fā)現(xiàn)，芹黃素可增加SAMP8小鼠的Syn蛋白與mRNA表達，芹黃素可能通過影響這一途徑改善SAMP8小鼠的學習記憶能力。

在突觸中，GAP-43是一種膜相關(guān)磷蛋白，在神經(jīng)發(fā)育時，它主要參與軸突生長，突觸重構(gòu)以及兒茶酚胺和神經(jīng)肽類物質(zhì)的分泌，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后，其表達下降并呈現(xiàn)區(qū)域性。與損傷神經(jīng)的軸突再生和軸突導向有關(guān)，是研究軸突可塑性機制的關(guān)鍵蛋白之一〔27〕。GAP43協(xié)同Syn在突觸間信息傳遞、突觸的生長、突觸的建立等突觸可塑性等過程中一同發(fā)揮重要作用Pfenninger等〔28～30〕的研究認為，突觸可塑性引起的 GAP43表達變化與突觸形態(tài)學上的改變及由LTP和LTD所引發(fā)的突觸效率的變化有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可引起SAMP8小鼠海馬GAP43蛋白與mRNA表達的增加，芹黃素可能通過影響增加GAP-43的表達，參與軸突的生長和突觸重構(gòu)，促進其學習記憶的恢復。

綜上所述，芹黃素可能通過增加Syn和GAP43的表達改善神經(jīng)信號的傳遞，促進損傷突觸的重建，提高學習記憶能力，芹黃素的這一作用機制提示它可能成為快速改善AD臨床癥狀的一條可行治療途徑。

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