黃益玲 胡火軍 尤程程 黃迎娣 黃利鳴 (三峽大學醫(yī)學院病理學系，湖北 宜昌 443002)

天花粉蛋白(TCS)是一種單鏈核糖體失活蛋白，從葫蘆科植物栝蔞的塊根中提取出來。TCS早期主要用于引發(fā)中期流產，近年研究表明，TCS有多種生物學活性，能夠抑制人獲得性免疫缺陷病毒復制、調節(jié)人體免疫功能、抑制腫瘤細胞生長〔1〕。關于TCS對人前列腺癌的抑制作用尚未見報道。本實驗主要研究TCS在體外對前列腺癌細胞(PC3細胞)的增殖抑制作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞與主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，噻唑藍(MTT)購于美國Amresco公司，碘化丙啶(PI)及RNA酶(RNase A)購自Sigma公司，一抗ERK、p-ERK、Cyclin D1購自 Cell Signal公司，β-actin、二抗 HRP 標記的IgG抗體購于Santa Cruz公司，TCS購自上海金山制藥廠。

1.2 細胞培養(yǎng) PCa PC3細胞為本實驗室傳代保存，培養(yǎng)于含10%的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的濕化孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT法測定TCS對PC3細胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的PC3細胞，以2×104個/ml的密度接種于96孔板，細胞貼壁 后 加 入 不 同 濃 度 的 TCS(0、20、40、60、80、100、120 μg/ml)，每個濃度設置6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h 后每孔加入5g/L的 MTT溶液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入200 μl DMSO溶解，測定570 nm處光吸收值，計算細胞生長抑制率。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期 離心收集經TCS處理的PC3細胞，用含0.2%FBS的PBS清洗，加75%的冰冷乙醇固定，10000 r/min條件下離心5 min，去乙醇，以PBS洗滌兩次，棄上清。用0.5 ml PBS重懸細胞沉淀，加入等體積的細胞裂解緩沖液(1%NP-40，50 mmol/L Tris-HCl，40 mmol/L EDTA，pH 值7.5)室溫作用5～10 min，離心后加入終濃度為30 μg/ml的RNase于37℃水浴中消化 30 min，離心，10000 r/min離心5 min，加人1 ml終濃度為50 μg/ml的 PI避光染色 30 min，上流式細胞儀檢測，Multicycles軟件分析結果。

1.5 Western印跡檢測 離心收集經不同濃度TCS處理的PC3細胞，加入適量的細胞裂解液(注意臨用前加入各種蛋白酶抑制劑)提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，保證樣本中含有相同的蛋白含量，置95℃ ～100℃沸水中變性5 min，加入等體積2×SDS-PAGE加樣緩沖液行12.5%的SDS-PAGE垂直電泳，電轉至PVDF膜，加50 g/L脂奶粉于室溫封閉1 h，PBST洗膜，分別加入一抗ERK、p-ERK、cyclin D1及β-actin于4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗滌3次，ECL反應液A和B混合后加至膜上1 min，最后X片顯影。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS14.0軟件行單因素方差分析。

2 結果

2.1 MTT法測定TCS對PC3細胞增殖的抑制作用 1 d TCS對PC3細胞的生長抑制作用隨其濃度的增大而加強，與未加藥物的對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度TCS作用24、48、72 h對PC3細胞增殖的抑制作用(±s，n=3)

表1 不同濃度TCS作用24、48、72 h對PC3細胞增殖的抑制作用(±s，n=3)

與0 μg/ml組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

g/ml 0±1.520±3.520±2.3420 μg/ml 6.3±2.1314.53±3.451) 23.49±2.642)40 μg/ml 11.2±1.741) 25.96±3.772) 42.12±4.232)60 μg/ml 19.7±3.222) 47.62±2.062) 66.63±3.222)80 μg/ml 23.63±1.692) 52.81±3.132) 70.34±4.142)100 μg/ml 38.5±2.752) 72.78±4.252) 82.98±2.672)120 μg/ml 57.8±3.622) 79.23±2.762) 91.21±3.542)24 h 48 h 72 h 0 μ組別

2.2 TCS對PC3細胞周期的影響 流式細胞儀檢測經20、40、80 μg/ml TCS作用24 h后PC3細胞周期情況，結果顯示，處于G1期的細胞比例分別為(37.4±0.45)%、(42.1±0.25)%、(59.9±0.09)%，與TCS未處理組(29.9±0.25)%相比差異顯著，表明TCS能引起PC3細胞發(fā)生G1期阻滯。

2.3 Western印跡檢測ERK、p-ERK、Cyclin D1表達 以β-actin為內參，經 20、40、80 μg/ml TCS 處理 PC3 細胞 24 h 后，p-ERK的表達受到抑制，且抑制作用隨藥物濃度的增加而加強，而Cyclin D1的表達呈明顯下降趨勢，見圖1。

圖1 TCS對P-ERK、ERK及Cyclin D1表達的影響

3 討論

部分前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)生侵襲和轉移〔2〕，晚期前列腺癌患者平均經過2年的內分泌治療后會進展為激素難治性TCS(HRPC)〔3〕，化療是激素難治性前列腺癌的主要治療手段。

細胞過度增殖會導致疾病的發(fā)生，甚至腫瘤的形成。抑制信號轉導通路中某一信號轉導分子的表達從而阻斷異?；罨男盘栟D導通路是腫瘤治療的策略之一。絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路存在于大多數(shù)細胞中，將細胞外刺激信號轉導至細胞內，引起細胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生化反應〔4〕。ERK信號通路是 1993 年由 Her等〔5〕人發(fā)現(xiàn)的一條MAPK信號通路。ERK1/2亞功能區(qū)中的酪氨酸和蘇氨酸殘基可發(fā)生磷酸化激活，激活的ERK1/2由胞質移位至細胞核后磷酸化一系列轉錄因子〔6〕，調控細胞的增殖和分化過程。細胞周期是細胞生命活動中的重要過程，其關鍵是G1期的啟動。Cyclin D1是Fu等〔7〕從甲狀旁腺腺瘤中克隆、鑒定出來的一種細胞周期蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白，Cyclin D1過表達可導致G1期縮短，降低細胞對外源性有絲分裂刺激的依賴性〔8〕，使腫瘤細胞不依賴于細胞外生長信號的刺激而反復自發(fā)進行細胞周期循環(huán)。

TCS在臨床上主要用于引產及宮外孕、葡萄胎、絨癌等疾病的治療，因其具有N糖苷酶活性，使核糖體發(fā)生不可逆性失活而抑制蛋白質的合成〔9〕，體外實驗發(fā)現(xiàn)TCS對結腸癌、肺癌、黑色素瘤等腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用〔1〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TCS能通過誘導凋亡抑制宮頸癌Hela細胞的生長〔10〕。本實驗顯示TCS能明顯抑制PC3細胞生長，隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，TCS對PC3細胞的生長抑制作用逐漸增大，具有時間及劑量依賴性。TCS抑制Pca細胞增殖的可能機制為TCS能抑制ERK磷酸化從而抑制ERK-MAPK信號通路活性，TCS誘導的G1期阻滯與前列腺癌抑制細胞周期調節(jié)蛋白Cyclin D1的表達有關。對前列腺癌抗癌機制的進一步研究，有望使其應用于前列腺癌等腫瘤的臨床治療。

1 Shawp C，Lee KM，Wong KB.recent advances in trichosanthin，a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties〔J〕.Toxicon，2005;45(6):683-9.

2 楊裕華，王際莘，賀法憲.前列腺癌二級預防研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(2):722-5.

3 Shen MM，Abate-Shen C.Molecular genetics of prostate cancer:new prospects for old challenges〔J〕.Genes Dev，2010;24(18):1967-2000.

4 Kim EK，Choi EJ.Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1802(4):396-405.

5 Her JH，Lakhani S，Zu K，et al.Dual phosphorylation and autophosphorylation in mitogen-activated protein(MAP)kinase activation〔J〕.Biochem J，1993;296(1):25-31.

6 De Luca A，Maiello MR，DAlessio A，et al.The RAS/RAF/MEK/ERK and the PI3K/AKT signalling pathways:role in cancer pathogenesis and implications for therapeutic approaches〔J〕.Expert Opin Ther Targets，2012;16(2):17-27.

7 Fu M，Wang C，Li Z，et al.Cyclin D1:normal and abnormal functions〔J〕.Endocrinology，2004;145(12):5439-47.

8 Seo JH，Jeong ES，Choi YK.Therapeutic effects of lentivirus-mediated shRNA targeting of cyclin D1 in human gastric cancer〔J〕.BMC Cancer，2014;14:175-80.

9 汪 猷，金善煒.天花粉蛋白〔M〕.第2版.北京:科學出版社，2000:158.

10 黃益玲，胡火軍，黃利鳴，等.天花粉蛋白誘導人宮頸癌Hela細胞凋亡的分子機制研究〔J〕.中國藥理學通報，2007;23(1):99-101.

〔2014-12-03修回〕