邱宇安等

[摘要] 目的 探討血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）對內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）分泌1型纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的影響及黃芪含藥血清對AngⅡ此效應(yīng)的干預(yù)作用。 方法 培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株，對照組與AngⅡ干預(yù)組：內(nèi)皮細(xì)胞與不同濃度AngⅡ共孵育18 h；黃芪含藥血清組：內(nèi)皮細(xì)胞在不同濃度黃芪藥血清培養(yǎng)基中培育24 h后，加入AngⅡ（×10-4 mol/L）培養(yǎng)18 h，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定PAI-1濃度。 結(jié)果 與對照組比較，不同濃度的AngⅡ均能刺激HUVECs分泌PAI-1；黃芪含藥血清可抑制AngⅡ促HUVECs分泌PAI-1的效應(yīng)。 結(jié)論 黃芪含藥血清可能通過抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs分泌PAI-1效應(yīng)，產(chǎn)生抗動脈粥樣硬化的作用。

[關(guān)鍵詞] 黃芪；血管緊張素Ⅱ；內(nèi)皮細(xì)胞；1型纖溶酶原激活物抑制劑

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）08（a）-0012-03

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是由血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用下，水解產(chǎn)生的多肽物質(zhì)，能產(chǎn)生多種生理效應(yīng)，促進(jìn)動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生、發(fā)展，其中包括影響凝血和纖溶系統(tǒng)的活性平衡，促進(jìn)血栓形成[1-3]。黃芪的藥用歷史悠久，臨床上黃芪注射液已用于治療冠心病、糖尿病腎病等疾病[4-5]。本實(shí)驗研究AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞分泌1型纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的誘導(dǎo)作用及黃芪含藥血清的干預(yù)效應(yīng)，探討黃芪含藥血清的血管保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

胎牛血清（美國Gibco公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；黃芪（江西省中醫(yī)院中藥房）；AngⅡ（美國Sigma公司）；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所）；Wistar大鼠（南昌大學(xué)實(shí)驗動物科學(xué)部）；PAI-1ELISA試劑盒（上海太陽生物技術(shù)公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo bioanalysis公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 不同劑量黃芪含藥血清的制備

黃芪用清水沖洗，浸泡2 h后，武火煎至水沸，改用文火繼續(xù)煎煮20 min，共煎3次，合并3次煎液，3000 r/min離心10 min，取上清液，60℃水浴，濃縮至含生藥1 g/ml[6]。20只Wistar大鼠隨機(jī)分4組（對照組，小劑量黃芪組，中劑量黃芪組，大劑量黃芪組）。以黃芪成人臨床日用量的大鼠等效劑量之1、2、4倍分別定義小、中、大劑量組。大鼠灌藥液4 ml/d，對照組予等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥1周，2次/d，于末次給藥后2 h從心臟取血，采用一次性非抗凝真空采血管收集全血，無菌操作。4℃靜置2 h，上低溫離心機(jī)，3500 rpm/min，離心15 min，分離血清，分離的血清同組混合，經(jīng)56℃恒溫滅活補(bǔ)體30 min處理后，超凈臺上用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗過程

ECV304在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以0.25%胰酶、0.02%EDTA消化、傳代。接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，孵育至亞融合狀態(tài)，進(jìn)行分組及實(shí)驗。

AngⅡ干預(yù)實(shí)驗。①空白對照組：未用AngⅡ，進(jìn)行正常培養(yǎng)；②不同濃度AngⅡ干預(yù)組：內(nèi)皮細(xì)胞與不同濃度AngⅡ（10-6、10-5、10-4 mol/L）共孵育18 h。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定各組培養(yǎng)上清液中PAI-1的含量。

黃芪含藥血清干預(yù)實(shí)驗。①空白對照組：培養(yǎng)液中不加誘導(dǎo)物，正常培養(yǎng)細(xì)胞。②陰性對照組：細(xì)胞在對照組大鼠血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。③黃芪含藥血清干預(yù)組：細(xì)胞分別在小、中、大劑量組大鼠血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。以上各組細(xì)胞培育24 h后，加入AngⅡ（10-4 mol/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)18 h。

采用ELISA測定各實(shí)驗組上清液中PAI-1的含量。每組設(shè)6個復(fù)孔，操作嚴(yán)格按檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以x±s表示，采用方差分析及q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1的影響

與空白對照組比較，不同濃度的AngⅡ均可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；不同AngⅡ濃度組之間比較，隨著AngⅡ濃度增加，促進(jìn)作用無顯著性差異（表1）。

2.2 黃芪含藥血清的干預(yù)效應(yīng)

與空白對照組比較，陰性對照組不顯著影響上清液中PAI-1的含量；用不同濃度的黃芪含藥血清干預(yù)后，PAI-1含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示黃芪含藥血清有抑制AngⅡ促內(nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1的作用（表2）。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是全身血管內(nèi)膜的屏障結(jié)構(gòu)，而且具有多方面的生理功能，可維持凝血和纖溶系統(tǒng)的活性平衡[7-8]。內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害是AS發(fā)病過程中重要的環(huán)節(jié)。

纖溶系統(tǒng)的活性主要取決于組織型纖溶酶原激活物（tPA）及其抑制物PAI-1之間的平衡，兩者主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是動脈粥樣硬化性疾病的獨(dú)立預(yù)測因子[9]。PAI-1可阻止tPA激活纖溶酶原，促進(jìn)血栓形成。PAI-1的濃度升高會明顯促進(jìn)AS的進(jìn)展[10]。研究表明，瘦素可通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1的分泌，產(chǎn)生對心血管系統(tǒng)的影響[11]。本實(shí)驗證實(shí)，AngⅡ可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1，與Brown等[12]研究結(jié)果相一致，說明AngⅡ可能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1改變凝血和纖溶系統(tǒng)的活性平衡，從而產(chǎn)生促進(jìn)AS的的效應(yīng)。

在我國，黃芪有2000多年的藥用歷史，東漢張仲景所著《金匱要略》上即記載有多個含黃芪的方劑。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃芪具有補(bǔ)中益氣、利水消腫之功效[13]?，F(xiàn)代體外實(shí)驗證實(shí)，黃芪注射液可通過加強(qiáng)對氧自由基的清除，維持血管內(nèi)皮的正常功能[14]。動物體內(nèi)實(shí)驗證實(shí)，黃芪具有抗動脈粥樣硬化的作用[15]。臨床試驗證實(shí)，黃芪可減輕心肌鈣超載損傷，改善心臟功能[16]。

本實(shí)驗旨在觀察黃芪對體外血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1的影響，以進(jìn)一步闡明黃芪保護(hù)血管內(nèi)皮的機(jī)制。若用中藥粗制劑直接加入體外的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)體系中，中藥本身復(fù)雜的理化性質(zhì)與雜質(zhì)成分等會對細(xì)胞的生長造成一定的影響，影響實(shí)驗結(jié)果。因此本實(shí)驗將中藥粗制劑給大鼠灌服后，用含有藥物成分的血清代替中藥粗制劑進(jìn)行體外實(shí)驗，排除上述各種影響因素的干擾，更接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過程[17-18]，提高了實(shí)驗結(jié)果的可信度。

本實(shí)驗證實(shí)黃芪含藥血清能抑制由AngⅡ所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞分泌PAI-1，說明黃芪含藥血清可改善內(nèi)皮纖溶活性，有助于動脈粥樣硬化血栓性疾病的防治。但其具體作用成分及分子生物學(xué)機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2015-03-16 本文編輯：王紅雙）