[摘要] 目的 探討腦發(fā)育期缺碘對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響。 方法 大鼠飲用含質(zhì)量濃度為0.3 g/L甲硫咪唑的自來水誘發(fā)腦發(fā)育不同時(shí)期缺碘大鼠模型，E1組為胚胎期缺碘模型鼠，P1組為出生后1～50 d缺碘模型鼠，P30組為出生后30～50 d缺碘模型鼠，N組為正常對(duì)照鼠。觀察其子代大鼠的行為學(xué)改變，利用放免法測(cè)定大鼠血清游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和四碘甲腺原氨酸（FT4）水平，采用HE染色及TUNEL法觀察大鼠的腦組織形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果 P30組的血清游離FT3和FT4水平顯著低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?！癥”迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P1和P30組的正確反應(yīng)率顯著低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的達(dá)標(biāo)所需天數(shù)顯著多于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的記憶保持率顯著低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的正確反應(yīng)率、記憶保持率顯著低于E1組，達(dá)標(biāo)所需天數(shù)顯著多于E1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的正確反應(yīng)率顯著低于P30組，達(dá)標(biāo)所需天數(shù)顯著多于P30組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組和P30組的皮質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著多于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的皮質(zhì)、海馬細(xì)胞凋亡數(shù)顯著多于E1組和P30組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的小腦細(xì)胞凋亡數(shù)顯著多于E1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 腦發(fā)育時(shí)期缺碘能夠?qū)е麓笫髮W(xué)習(xí)記憶功能發(fā)育障礙，其發(fā)生與腦組織細(xì)胞凋亡增多有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腦發(fā)育；缺碘；大鼠；學(xué)習(xí)記憶功能

[中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）07（b）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the influence of iodine deficiency in brain development on rat′s learning and memory functions. Methods Iodine deficiency models of rats in different periods of brain development were induced by drinking tap water containing 0.3 g/L thiamazole.Iodine deficiency of model rat in embryonic period was classified into E1 group，iodine deficiency of model rats 1 to 50 d and 30 to 50 d after birth were named as P1 group and P30 group respectively，and normal control group was set as N group.Change of behavioristics in offspring rats was observed.Serum free triiodothryonine （FT3） and free thyroxine or tetraiodothyronine （FT4） was determined by radioimmunoassay respectively.Morphological change of rat′s brain tissue was observed by HE staining and TUNEL. Results The level of serum FT3 and FT4 in P30 group was lower than that in E1 group and P1 group，with significant difference（P<0.05）.In the “Y” maze experiments，the rate of correct response in P1 group and P30 group N group was lower than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The rate of memory retention in P1 group was lower than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The rate of correct response and memory retention in P1 group was lower than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）.The rate of correct response in P1 group was lower than that in P30 group，with significant difference（P<0.05）.The days of reachting the standards in P1 group was more than that in P30 group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebral cortex cell in P1 group and P30 group was more than that in N group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebral cortex and hippocampus cell was more than that in E1 group and P30 group，with significant difference（P<0.05）.The apoptosis number of cerebellum cell was more than that in E1 group，with significant difference（P<0.05）. Conclusion Iodine deficiency in brain development can lead to disorders of learning and memory functions in rats，which is probably related with apoptosis of brain tissue.

[Key words] Brain development；Iodine deficiency；Rat；Learning and memory functions

碘是合成甲狀腺激素的必需原料，而甲狀腺激素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用，尤其是對(duì)大腦發(fā)育，是非常重要的一種激素。如果在腦發(fā)育時(shí)期碘缺乏或不足，將發(fā)生嚴(yán)重的腦功能障礙；如果孕婦孕期缺碘或嬰兒出生后母乳、飲食缺碘可出現(xiàn)感覺遲鈍、步態(tài)異常和智力減弱等癥狀，而早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是防治的關(guān)鍵[1-3]。調(diào)查研究顯示，腦發(fā)育期碘缺乏可引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙及智力低下[4-5]。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為這一現(xiàn)象的發(fā)生與腦組織細(xì)胞凋亡增多密切相關(guān)[6]。本研究通過觀察腦發(fā)育不同時(shí)期缺碘大鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能及腦組織形態(tài)學(xué)的不同變化，探討缺碘對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能形成及發(fā)育的影響，旨在為甲狀腺功能減退患兒的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠20只（雌雄比為3∶1），由省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心買進(jìn)。在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)1周，待其適應(yīng)環(huán)境后，雌雄大鼠按3：1合籠。②主要試劑：甲硫咪唑從美國Sigma公司官網(wǎng)郵購，TUNEL試劑盒由國內(nèi)南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供，放免試劑盒從天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司郵購。

1.2 方法

1.2.1 缺碘大鼠模型制備[7]及分組[8] 本實(shí)驗(yàn)共分4組，具體分組如下。第1組（胚胎期缺碘模型組）：懷孕母鼠從懷孕的第1天開始至仔鼠出生，飲用含質(zhì)量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水，母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂養(yǎng)期）飲用正常自來水；仔鼠在出生后21 d斷奶，直至出生后50 d的這段時(shí)間內(nèi)飲用正常自來水；雌雄仔鼠分開飼養(yǎng)，簡(jiǎn)寫為E1組。第2組（出生后1～50 d缺碘模型組）：母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂養(yǎng)期）飲用含質(zhì)量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水，仔鼠在出生后21 d斷奶，直至出生后50 d的這段時(shí)間內(nèi)飲用含質(zhì)量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水；雌雄仔鼠分開飼養(yǎng)，簡(jiǎn)寫為P1組；第3組（出生后30～50 d缺碘模型組）：母鼠在仔鼠出生后的1～21 d（母乳喂養(yǎng)期）飲用正常自來水，仔鼠在出生后21 d斷奶，在出生后30～50 d飲用含質(zhì)量濃度為0.3 g/L的甲硫咪唑自來水；雌雄仔鼠分開飼養(yǎng)，簡(jiǎn)寫為P30組；第4組（正常對(duì)照組）：母鼠和仔鼠均飲用正常自來水，直至仔鼠出生后50 d。

1.2.2 血清游離FT3和FT4的測(cè)定 N組出生后第1天和第50天取血，E1組出生后第1天取血，P1和P30組出生后第50天取血。心臟取血經(jīng)離心后保存，樣品全部收集后統(tǒng)一拿到華僑醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，在專業(yè)人員協(xié)助下完成測(cè)定。

1.2.3 “Y”迷宮實(shí)驗(yàn) 本研究選用固定次數(shù)隨機(jī)不休息法[9]，“Y”迷宮實(shí)驗(yàn)中的正確、錯(cuò)誤判定標(biāo)準(zhǔn)如下：實(shí)驗(yàn)大鼠受到電擊后，迅速從起步區(qū)直接逃到安全區(qū)記錄為“正確反應(yīng)”；若是逃到其他無燈光的任何一臂，則記錄為“錯(cuò)誤反應(yīng)”；若是實(shí)驗(yàn)大鼠轉(zhuǎn)身向所在的起步區(qū)反方向逃竄也記錄為“錯(cuò)誤反應(yīng)”。各組大鼠在出生后的第45～50天由專人負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)，每天于相同時(shí)間、相同地點(diǎn)，固定訓(xùn)練20次，測(cè)試結(jié)果分為以下兩種：①20次測(cè)試中連續(xù)正確反應(yīng)次數(shù)≥9次；②20次測(cè)試中總的正確反應(yīng)次數(shù)≥18次。如果①和②滿足一個(gè)，則記為達(dá)標(biāo)。本研究選用正確反應(yīng)率、達(dá)標(biāo)所需天數(shù)、24 h記憶保持率3個(gè)指標(biāo)反映被測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

1.2.4 腦組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 各實(shí)驗(yàn)組大鼠在出生后的第50天灌注取腦，本研究選用的麻醉方法為腹腔注射350 mg/kg的水合氯醛，首先剪開心包，暴露大鼠的心臟，然后在心尖部位插管到升主動(dòng)脈，再用止血鉗把針頭固定，接著再剪開右心耳，快速注入溫度為37℃的生理鹽水200 ml，再緩慢注入溫度為4℃、體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液200 ml。灌注、固定實(shí)驗(yàn)步驟完成后，手術(shù)取出完整腦組織，將大鼠的大、小腦分別裝于盛有體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液的容器中浸泡、固定24 h以上，然后做石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，每片厚約4 μm，部分切片做HE染色，觀察大鼠腦組織的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。另外，部分切片采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，具體操作方法參考原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書。各組大鼠隨機(jī)選取不同腦區(qū)的5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，均數(shù)間兩兩比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清游離FT3和FT4水平的比較

P30組的血清游離FT3和FT4水平顯著低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。E1和P1組的血清游離FT3和FT4水平低于檢測(cè)限或無檢測(cè)結(jié)果（表1）。

2.2 各組“Y”迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

P1和P30組的正確反應(yīng)率顯著低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的達(dá)標(biāo)所需天數(shù)顯著多于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的記憶保持率顯著低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的正確反應(yīng)率、記憶保持率顯著低于E1組，達(dá)標(biāo)所需天數(shù)顯著多于E1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的正確反應(yīng)率顯著低于P30組，達(dá)標(biāo)所需天數(shù)顯著多于P30組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（表2）。

2.3 各組HE染色結(jié)果的比較

光鏡下N組大鼠的腦組織HE染色結(jié)果顯示，腦組織分層清晰，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞界限清晰，多有突起，胞質(zhì)豐富，胞核大而且圓，核仁清晰可見。與N組比較，P1組大鼠的腦組織HE染色結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞皺縮，細(xì)胞體積縮小，可見細(xì)胞外空隙、胞核固縮、深染（圖1）。

P1組和P30組的皮質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著多于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的皮質(zhì)、海馬細(xì)胞凋亡數(shù)顯著多于E1組和P30組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P1組的小腦細(xì)胞凋亡數(shù)顯著多于E1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3，圖2）。

3 討論

地方性克汀病又稱地方性呆小病，是胚胎期和新生兒期嚴(yán)重缺碘的結(jié)果。本病病因比較明確，主要是由于缺碘影響甲狀腺激素合成而導(dǎo)致。某些以神經(jīng)型表現(xiàn)為主的地方性克汀病就是由于胚胎早期嚴(yán)重的宮內(nèi)碘缺乏損害神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育所致，其臨床表現(xiàn)為身高低于正常，其中甲狀腺腫大者占15.3%，多數(shù)為輕度腫大，智力呈中至重度減退；表情淡漠、聾啞、精神缺陷、痙攣性癱瘓、眼斜視；膝關(guān)節(jié)屈曲、膝反射亢進(jìn)，可出現(xiàn)病理反射，如巴賓斯基征陽性；無明顯的甲狀腺功能減退表現(xiàn)。亞臨床型甲狀腺功能減退患者尤其是兒童患者，其認(rèn)知功能損害比較明顯，表現(xiàn)為分類、領(lǐng)悟、編碼、知識(shí)、言語等各項(xiàng)指標(biāo)均低于對(duì)照組[10]。相關(guān)研究顯示，在腦發(fā)育期，缺碘導(dǎo)致的甲狀腺功能減退患者記憶能力明顯降低[11-12]。先天性甲狀腺功能減退大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期、游泳路程延長(zhǎng)，游泳速度減慢[13]。出生后50 d的甲狀腺功能減退仔鼠在避暗實(shí)驗(yàn)中達(dá)標(biāo)所犯次數(shù)明顯增多，24 h記憶潛伏期明顯縮短[5-6，14]。本研究結(jié)果顯示，P1組和P30組缺碘大鼠在“Y”迷宮實(shí)驗(yàn)中的正確反應(yīng)率顯著降低，P1組缺碘大鼠在“Y”迷宮實(shí)驗(yàn)中的達(dá)標(biāo)所需天數(shù)顯著延長(zhǎng)，記憶保持率顯著降低，提示甲狀腺激素在腦功能發(fā)育中尤其是在學(xué)習(xí)記憶功能的發(fā)育和形成過程中有重要作用。

海馬一直被認(rèn)為是認(rèn)知功能形成和發(fā)育的重要解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其參與學(xué)習(xí)記憶功能的形成。海馬中的CA1區(qū)域和大腦空間學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)，記憶在這個(gè)區(qū)域編碼、存儲(chǔ)。研究顯示，有幾種重要基因參與學(xué)習(xí)記憶功能的形成，即早基因在長(zhǎng)時(shí)記憶形成中發(fā)揮重要作用，這一作用和神經(jīng)元的可塑性有關(guān)。甲狀腺功能減退時(shí)，海馬組織中的即早基因表達(dá)降低[15-16]，印證了這一觀點(diǎn)。缺碘導(dǎo)致的甲狀腺激素合成減少可導(dǎo)致海馬功能受損，尤其是對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的損害表現(xiàn)更為明顯，如水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果更差，而且受損的嚴(yán)重程度和體內(nèi)甲狀腺激素降低或不足的程度、持續(xù)時(shí)間及發(fā)生年齡有密切關(guān)系[17]。相關(guān)研究顯示，即使從母鼠懷孕第6天開始直至仔鼠出生后第30天，母鼠口服較低劑量甲狀腺激素合成抑制藥物（丙基硫氧嘧啶）引起的甲狀腺激素缺乏也可導(dǎo)致仔鼠海馬CA1區(qū)和鋸齒狀腦回的突觸傳遞混亂，即突觸的可塑性混亂，嚴(yán)重者可引起海馬學(xué)習(xí)記憶功能損害[18]。腦發(fā)育期甲狀腺激素合成不足或減少可明顯導(dǎo)致海馬CA1區(qū)以及齒狀回區(qū)LTP的表現(xiàn)和特性出現(xiàn)異常改變[17，19]。相關(guān)研究顯示，甲狀腺功能減退大鼠海馬CA3區(qū)的LTP明顯降低[20]。本研究結(jié)果顯示，P1組缺碘大鼠的腦組織海馬HE染色鏡下可見凋亡細(xì)胞皺縮、細(xì)胞體積明顯縮小以及細(xì)胞外空隙、細(xì)胞核固縮、深染；TUNEL染色可見陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）數(shù)明顯增多，提示海馬發(fā)育障礙是腦發(fā)育期缺碘導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的重要生理病理基礎(chǔ)之一。

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（收稿日期：2015-02-06 本文編輯：祁海文）