劉學(xué)廷

摘 要 DNA分子復(fù)制需要引物，體內(nèi)DNA分子復(fù)制需要RNA作為引物，復(fù)制結(jié)束后將引物切除，并通過相關(guān)酶補(bǔ)齊引物切除后留下的空隙；DNA體外擴(kuò)增時(shí)需要DNA引物，復(fù)制結(jié)束時(shí)不需要切除引物，但對DNA引物設(shè)計(jì)和合成提出了較高的要求。

關(guān)鍵詞 RNA引物 DNA引物 引物切除 引物設(shè)計(jì)

中圖分類號 Q-49 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 E

近幾年，有關(guān)“引物”的題目頻繁地出現(xiàn)在各地調(diào)研題和高考題中，而現(xiàn)有高中生物教材中只提及PCR需要引物，而引物是什么？引物從哪兒來？引物的作用是什么？為什么需要引物？是否所有DNA復(fù)制都需要引物？如何切除引物？……這些相關(guān)知識在教材中并沒有提及。為了對“引物”有較全面的了解，下面參考有關(guān)資料，對引物相關(guān)知識作概括和補(bǔ)充。

1 引物的涵義

DNA分子復(fù)制不能從頭開始，必須從一段已經(jīng)存在的核苷酸鏈上延伸，這一段核苷酸序列就是引物，又稱“引子”。在生物體內(nèi)，DNA分子復(fù)制所需引物主要是一小段RNA分子，但如果在體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增，引物一般是一小段人工合成的DNA分子。

DNA每一次復(fù)制時(shí)一般需要兩個引物，一個引物與DNA一條DNA模板鏈一端互補(bǔ)，另一個引物與另一條DNA模板鏈的另一端互補(bǔ)。

少數(shù)DNA分子復(fù)制時(shí)不需要引物，某些病毒如M13噬菌體內(nèi)的DNA為單鏈環(huán)狀DNA分子，可通過滾環(huán)方式進(jìn)行復(fù)制：M13噬菌體進(jìn)入大腸桿菌后，先形成復(fù)制型雙鏈環(huán)狀DNA分子，然后在M13噬菌體的雙鏈DNA環(huán)狀分子一條鏈（正鏈）上切一個切口，產(chǎn)生游離的3′-羥基作為延伸起點(diǎn)，最后在宿主細(xì)胞DNA聚合酶III的催化下，以另一條單鏈即負(fù)鏈為模板不斷地合成新的正鏈（圖1）。此過程不需要新的引物，直接以原有正鏈的切口處3′-羥基為引物連接上新的脫氧核苷酸。

2 DNA分子復(fù)制時(shí)需要（RNA）引物的原因

無論體內(nèi)還是體外，DNA的復(fù)制均需要DNA聚合酶，但DNA聚合酶必須從一小段已存在的核酸（DNA或RNA）開始，把新的核苷酸添加到該段核酸的3′-OH上，也就是說DNA聚合酶只能延長一段核酸鏈的3′端，而引物就提供了這段核酸鏈的3′-OH，所以DNA分子復(fù)制時(shí)需要引物。

大多數(shù)DNA分子復(fù)制時(shí)引物為什么是一小段RNA而不是DNA，這主要與DNA分子復(fù)制具有高度的忠實(shí)性有關(guān)：在DNA分子復(fù)制剛剛開始的時(shí)候，最初加入的核苷酸難以與模板形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致堿基很容易發(fā)生錯配，從而產(chǎn)生變異，而DNA原有的校正系統(tǒng)難以識別這一小段核苷酸序列，這不利于DNA分子的穩(wěn)定性。但如果用RNA做為引物，即使出現(xiàn)差錯也不要緊，因?yàn)镈NA聚合酶可識別這些異常的核苷酸序列并將引物切除，從而保證了DNA分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。另外，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA不需要引物，所以在體內(nèi)合成RNA引物比DNA引物更容易。

若在體外進(jìn)行DNA分子擴(kuò)增，則以一對已知序列的DNA片段作為引物。一個標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)系統(tǒng)包括：DNA模板、耐熱的DNA聚合酶（如Taq酶）、一對引物、4種dNTP、合適的Mg2+和一定體積的緩沖液等。由于PCR反應(yīng)系統(tǒng)不能切除RNA引物，這不利于DNA分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。而體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，有專門的酶將RNA引物切除。另外，體外DNA復(fù)制所需引物需人工合成，無論是序列的測定還是合成，DNA片段較RNA片段更容易。

3 復(fù)制后“引物”的切除與補(bǔ)齊

DNA分子體內(nèi)復(fù)制所需引物主要是一小段RNA，RNA引物只是啟動DNA復(fù)制，但在復(fù)制結(jié)束后，引物必須切除，否則混雜RNA片段的DNA分子影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，也影響遺傳信息的傳遞與表達(dá)。在原核細(xì)胞內(nèi)，切除RNA引物的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H，其中DNA聚合酶I既有5′→3′方向延伸脫氧核苷酸鏈功能，還具有5′→3/和3′→5/外切核酸酶的活性，所以DNA聚合酶I憑借5’-外切酶的活性切除總是位于5′端的RNA引物。核糖核酸酶H是一種特殊的內(nèi)切核酸酶，專門水解與DNA雜交的RNA，包括RNA引物，如T4噬菌體DNA復(fù)制中引物的切除，也可通過宿主細(xì)胞的DNA聚合酶I切除。而真核細(xì)胞的任何一種DNA聚合酶均沒有5/-外切酶活性，因此負(fù)責(zé)切除RNA引物的酶主要是核糖核酸酶H。切除后的DNA片段由DNA連接酶連接在一起形成連續(xù)的DNA鏈。如果是體外DNA復(fù)制，由于引物是DNA片段，所以不需要切除引物。

當(dāng)真核細(xì)胞的線型DNA復(fù)制到最后，位于末端的RNA引物被切除后，會留下一段空隙得不到補(bǔ)充，長期下去，末端DNA就會越來越短。因此必須填補(bǔ)末端RNA引物被切除后留下的空隙，這個過程主要靠端聚酶來完成，端聚酶由蛋白質(zhì)和RNA兩種成分組成，其中蛋白質(zhì)具有反轉(zhuǎn)錄酶的活性。具體過程如下：首先是以端聚酶中的RNA為模板，在端聚酶中的反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成DNA片段，從而延伸線型DNA一條鏈的3′端，然后再以延伸的DNA片段為模板，合成新的岡崎片段，最終填補(bǔ)RNA引物被切除后留下的空隙（圖2）。

如果是其他類型的線型DNA，如某些噬菌體的線型DNA、某些真核細(xì)胞病毒的線型DNA等，它們的引物被切除后留下的空隙可通過將線型DNA暫時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)形DNA，或通過滾環(huán)復(fù)制等方式解決。

4 “引物”的設(shè)計(jì)

體內(nèi)DNA復(fù)制所用引物一般為RNA片段，在復(fù)制結(jié)束后被切除，而體外擴(kuò)增DNA使用的是DNA引物，在DNA擴(kuò)增結(jié)束后不被切除，這就對引物有了極高的要求。

在體外合成DNA引物時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：① 引物的長度一般為15～30 bp（堿基對），其有效長度（是指與模板配對的引物長度，不包括5′末端添加的序列）一般不大于38 bp，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶）的最佳作用溫度（74度），從而降低產(chǎn)物的特異性。當(dāng)然引物的長度也不能過短，否則會增加錯配現(xiàn)象。② G和C的含量應(yīng)在40%～60%之間，引物G和C的含量過低，會導(dǎo)致PCR過程中退火溫度較低，不利于提高PCR的特異性，但G和C的含量過高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。③ 引物堿基盡可能隨機(jī)分布，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，尤其是不應(yīng)在其3′端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。另外，引物上游和下游引物的G和C的含量最好相近，不能相差太大。④ 引物自身不能含有互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致引物不能和模板結(jié)合。兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補(bǔ)或同源堿基，不然會形成引物二聚體。⑤ 引物3′端最后一個堿基應(yīng)嚴(yán)格與模板互補(bǔ)配對，否則影響PCR擴(kuò)增效率。⑥ 引物3′端最后一個堿基應(yīng)選在密碼子的第一個或第二個核苷酸上。由于堿基擺動，大多數(shù)密碼子具有簡并性，編碼同一個氨基酸的密碼子第三個堿基可以有差異。⑦ 引物3′端最后一個堿基最好選擇G或C，不選A。有資料表明，當(dāng)末位為T時(shí)，即使在錯配的情況下也能引發(fā)鏈的合成，而末位為A時(shí)，錯配時(shí)引發(fā)率大大降低，而當(dāng)末位堿基為T時(shí)，錯配的情況下也能引發(fā)的合成，當(dāng)末位堿基為G、C時(shí)錯配的引發(fā)率居中。因此，應(yīng)盡量避免引物3′端的第一位堿基是A，引物3′端最佳堿基的選擇是G和C，因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對比較穩(wěn)定。

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