李 飛, 任 清, 季 超, 侯 昌

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048)

苦蕎籽粒黃酮的提取純化及抗氧化活性研究

李 飛, 任 清*, 季 超, 侯 昌

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048)

利用響應(yīng)面分析法對(duì)苦蕎籽粒總黃酮提取工藝進(jìn)行研究。以苦蕎粉為原料,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響,利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),建立二次回歸方程,得到苦蕎籽粒黃酮的較佳提取工藝為:液料比(mL/g)20∶1,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,提取溫度70℃,提取時(shí)間4 h,此條件下提取率為2.632%。通過(guò)測(cè)定純化后苦蕎籽粒黃酮對(duì)O-2·的清除率、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力、還原力和DPPH自由基清除率,分析其抗氧化能力,并用抗壞血酸做陽(yáng)性對(duì)照,結(jié)果顯示苦蕎籽粒總黃酮具有還原力。通過(guò)SPSS軟件分析,得到其抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力、清除O-2·能力和清除DPPH能力的IC50值分別1.115,0.498,2.235 μg/mL,表明苦蕎籽粒黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

苦蕎籽粒;黃酮;響應(yīng)面分析;抗氧化活性

苦蕎(Fagopyrum tataricum)是一年生的雙子葉作物,蓼科(Polygonaceae),蕎麥屬(Fagopyrum)。它是一種藥食兩用作物,含有的蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉、粗纖維和黃酮類化合物等都高于普通蕎麥[1]。苦蕎中還富含酚類、無(wú)機(jī)鹽和微量元素等多種活性成分,其中主要是黃酮類化合物和糖醇[2]。這些活性物質(zhì)的存在賦予了苦蕎降血脂、降血糖[3-4]等功效。

苦蕎黃酮類是苦蕎中一種重要的活性物質(zhì),有抗氧化、抗腫瘤降血脂、降血壓、增強(qiáng)心血管功能[5]的特殊功效,因此通過(guò)對(duì)苦蕎籽粒黃酮提取條件的優(yōu)化來(lái)提高苦蕎黃酮的提取率有非常重要的意義。響應(yīng)面法越來(lái)越多地應(yīng)用于各種優(yōu)化試驗(yàn)中,它可以通過(guò)較少的試驗(yàn)次數(shù)得到最優(yōu)的提取條件[6]。對(duì)自由基的清除率及物質(zhì)的還原力是反映該種物質(zhì)抗氧化能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。許多研究表明,氧自由基及其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)與一些免疫性損傷和炎性損傷有很大的關(guān)系。而黃酮類物質(zhì)作為一種天然的抗氧化劑,具有很高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)以溶液浸提法在脫脂苦蕎粉中提取黃酮,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6中響應(yīng)曲面法的Box-Behnken模式對(duì)苦蕎黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,確定苦蕎黃酮最佳的提取工藝;通過(guò)測(cè)定樣品清除O-2·的能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力、還原力和清除DPPH自由基的能力4個(gè)方面來(lái)分析和評(píng)價(jià)苦蕎籽粒黃酮的抗氧化活性,為苦蕎黃酮天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麥產(chǎn)于河北張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。大孔吸附樹(shù)脂,北京迪朗生化科技有限公司;蘆丁對(duì)照品(98%),百靈威科技有限公司;抗壞血酸,北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

DPPH為進(jìn)口分裝試劑,三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、磷酸鹽緩沖液(PBS)、Tris-HCl、三氯化鐵、水楊酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī),北京中興偉業(yè)儀器有限公司;DSHZ-300A型水浴恒溫振蕩器,太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;T6型新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TDL-5-A型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎黃酮的提取[7]

將苦蕎籽粒清洗,50℃烘箱干燥24 h,粉碎,過(guò)100目篩,60～90℃石油醚于恒溫水浴搖床中60℃脫脂9 h,減壓抽濾,干燥,得脫脂苦蕎粉。準(zhǔn)確稱取4.00 g脫脂苦蕎粉,加入不同濃度的乙醇溶液,于恒溫水浴搖床中提取一定時(shí)間,提取液減壓抽濾后得苦蕎黃酮樣品液。樣品液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥得到苦蕎黃酮粗提物。將苦蕎黃酮粗提物以一定濃度復(fù)溶于去離子水中,大孔樹(shù)脂吸附純化得苦蕎總黃酮。

1.3.2 黃酮含量的測(cè)定

將黃酮樣品液用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液定容至一定體積,混勻,以蘆丁為對(duì)照品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法[8]測(cè)定樣品液中的黃酮含量。

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于120℃烘箱中烘至恒重,于干燥器中冷卻,精密稱取0.030 g冷卻后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解,定容至100 mL,得質(zhì)量濃度為0.300 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[9]

分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL于25 mL比色管中,用70%乙醇定容至12.5 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液0.7 mL,混勻,靜置5 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液0.7 mL,靜置6分鐘后加入濃度為1 mol/L的NaOH溶液5 mL,70%乙醇定容至25 mL,混勻,靜置10 min后用1 cm比色皿于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,同時(shí)用70%乙醇溶液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液作為參比,以所測(cè)得的吸光度A為橫坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度Y(mg/mL)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得蘆丁質(zhì)量濃度Y與吸光度A的回歸方程:Y=2.005A+0.007 2,方程R2為0.999 6,說(shuō)明該方程在0～1.8 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。

1.3.4 總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1.0 mL稀釋一定倍數(shù)的苦蕎黃酮粗樣品液于25 mL比色管中,按照1.3.3.2節(jié)方法測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程得出苦蕎黃酮的質(zhì)量濃度,計(jì)算出苦蕎中總黃酮的提取率,見(jiàn)式(1)。

式(1)中,c為計(jì)算得出的黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V為定容的體積,mL;N為樣品稀釋倍數(shù);m為脫脂苦蕎粉的質(zhì)量,g。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

液料比的確定:取脫脂苦蕎粉4.00 g,按液料比(mL/g)分別為5∶1,10∶1,15∶1,20∶1,25∶1加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇,于水浴恒溫振蕩器中70℃提取4 h,減壓抽濾,測(cè)浸提液中黃酮含量。

乙醇濃度的確定:取脫脂苦蕎粉4.00 g,按液料比15∶1分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%,60%,70%,80%,90%的乙醇,于水浴恒溫振蕩器中70℃提取4 h,減壓抽濾,測(cè)浸提液中黃酮含量。

提取溫度的確定:取脫脂苦蕎粉4.00 g,按液料比15∶1分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇于水浴恒溫振蕩器中分別在50,60,70,80℃條件下提取4 h,減壓抽濾,測(cè)浸提液中黃酮含量。

提取時(shí)間的確定:取脫脂苦蕎粉4.00 g,按液料比15∶1分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇于水浴恒溫振蕩器中,70℃分別提取2,3,4,5,6 h,減壓抽濾,測(cè)浸提液中黃酮含量。

1.5 苦蕎籽粒黃酮提取響應(yīng)面法優(yōu)化分析

本試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)選取液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)對(duì)苦蕎黃酮提取率影響較大的因素,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)提取工藝進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

1.6 AB-8型樹(shù)脂純化工藝

1.6.1 樹(shù)脂的預(yù)處理

將大孔樹(shù)脂于一定量體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液中浸泡24 h,用乙醇洗至留出液加水不渾濁,去離子水浸泡,洗至無(wú)醇味后備用[10]。

1.6.2 AB-8型大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及解析

準(zhǔn)確稱取處理好的AB-8型樹(shù)脂,按比例加入已知濃度的苦蕎籽粒粗黃酮溶液,室溫下吸附6 h,每隔一定時(shí)間用分光光度法測(cè)定吸附后溶液中黃酮含量。吸附后溶液減壓抽濾,得吸附后樹(shù)脂,加入一定量70%乙醇溶液,室溫解析4 h,每隔一定時(shí)間測(cè)定解吸溶液中的黃酮含量。將解析液進(jìn)行減壓抽濾,濾液經(jīng)真空濃縮除去乙醇,冷凍干燥,得純化后的苦蕎籽粒黃酮,按1.3.2的方法測(cè)定黃酮純度。吸附量Q(mg/g)和解析率(%)的計(jì)算公式如式(2):

式(2)中,Q為每克樹(shù)脂的吸附量,mg/g;P為樹(shù)脂的解析率,%;C0為初始溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;Ct為吸附后溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;Cp為解析后溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;Vp為解析后溶液體積,mL;V0為初始溶液體積,mL;Vt為吸附后溶液體積,mL;W為濕樹(shù)脂質(zhì)量,g。

1.7 苦蕎籽粒黃酮抗氧化性的測(cè)定

1.7.1 測(cè)定清除O2-·自由基能力[11]

采用鄰苯三酚自氧化測(cè)定:取pH 8.2,0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液4.5 mL,去離子水4.2 mL,25℃保溫20 min,立即加入0.3 mL以10 mmol/L HCl配制的鄰苯三酚溶液,快速混勻,倒入比色皿,每隔30 s測(cè)其320 nm處的吸光度,HCl溶液代替鄰苯三酚作為參比,計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值ΔA0。

苦蕎籽粒黃酮活性測(cè)定:先分別加入1.0 mL各梯度質(zhì)量濃度的黃酮溶液和3.2 mL蒸餾水,再加鄰苯三酚并進(jìn)行后續(xù)操作,計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值ΔA1?？箟难嶙麝?yáng)性對(duì)照。

1.7.2 測(cè)定抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力[12]

將1 mL 10 mg/mL大豆卵磷脂溶液、1 mL 0.4 mmol/L的硫酸亞鐵溶液及1 mL樣品依次加入到10 mL離心管。避光37℃水浴60 min,加入TCATBA-HCl混合液2 mL,95℃水浴15 min,冷水冷卻,4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,測(cè)上清液在535 nm處吸光度Ap,1 mL去離子水代替卵磷脂作參比?？瞻坠芤? mL去離子水代替樣品,測(cè)其吸光度Aq?？箟难嶙麝?yáng)性對(duì)照。

1.7.3 測(cè)定還原力[11]

向比色管中依次加入pH 6.6的PBS 2.5 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為l%的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL和不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.5 mL,混勻,50℃水浴20 min,快速冷卻,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%TCA溶液2.5 mL,4 000 r/min離心10 min。取5.0 mL上清液,加入蒸餾水4.0 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液1.0 mL,充分混勻,靜置10 min后,700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度?？箟难嶙鲫?yáng)性對(duì)照,吸光度越大則還原力越強(qiáng)。

1.7.4 測(cè)定清除DPPH自由基的能力[13]

取2 mL 2×10-4mol/L DPPH的乙醇溶液2 mL及不同質(zhì)量濃度樣品溶液2 mL,依次加入比色管中,混勻,室溫放置30 min,以無(wú)水乙醇作參比,測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)下的吸光度。相同方法測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH溶液混合后的吸光度A1,以及2 mL樣品液與2 mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度A2,抗壞血酸做陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算樣品對(duì)DPPH的抑制率:

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)苦蕎籽?？傸S酮提取率的影響

液料比和黃酮提取率的關(guān)系如圖1。由圖1可知,隨著液料比的增加,苦蕎總黃酮提取率也逐漸增大。當(dāng)液料比為15∶1(mL/g)時(shí),苦蕎黃酮提取率達(dá)到峰值,超過(guò)該比例后,黃酮提取率略有所下降后趨于穩(wěn)定,故選擇液料比為15∶1。

圖1 不同液料比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on flavonoid yield

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)和黃酮提取率的關(guān)系如圖2。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,苦蕎總黃酮提取率顯著增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)黃酮提取率達(dá)到峰值,超過(guò)該體積分?jǐn)?shù)后黃酮提取率反而減小。這可能是因?yàn)楦邼舛鹊囊掖际挂恍┐既苄缘碾s質(zhì)溶解度增加,影響了黃酮的溶解度,使提取率有所降低[14]。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on flavonoids yield

2.1.3 提取溫度對(duì)苦蕎總黃酮提取率的影響

提取溫度和黃酮提取率的關(guān)系如圖3。在50～70℃,苦蕎黃酮提取率隨著溫度的升高而有明顯升高,70℃時(shí)達(dá)到峰值。繼續(xù)升高溫度,黃酮提取率有所下降,這可能是過(guò)高的提取溫度加快了乙醇溶液的蒸發(fā),從而降低了提取率。而且高溫也會(huì)導(dǎo)致黃酮的結(jié)構(gòu)被氧化破壞。因此提取溫度選在70℃為宜。

圖3 不同提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on flavonoids yield

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)苦蕎總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間和黃酮提取率的關(guān)系如圖4。提取時(shí)間為4 h時(shí),苦蕎黃酮提取率最大,繼續(xù)加長(zhǎng)提取時(shí)間,黃酮提取率反而減小,這可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)溶劑揮發(fā)、黃酮被氧化損失等原因所致?？紤]到時(shí)間及能源節(jié)約等問(wèn)題,提取時(shí)間最終選擇4 h。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on flavonoids yield

2.2 苦蕎黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面分析因素及水平

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析因素水平見(jiàn)表1。

表1 苦蕎中總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Factors and levels in response surface design of flavonoids extraction

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)共有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),24個(gè)析因點(diǎn),5個(gè)中心點(diǎn),零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次,用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)中的誤差。本試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析,分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 苦蕎中黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Response surface design arrangement and experimental results of flavonoids extraction

表3 響應(yīng)面法對(duì)黃酮提取率的ANOVA分析結(jié)果Tab.3 ANOVA of constructed regression model of flavonoids extraction

4個(gè)因子經(jīng)擬合得到與黃酮提取率Y相關(guān)的回歸方程見(jiàn)式(6):

試驗(yàn)的方差分析中,當(dāng)P值小于0.05即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著。從表3的分析結(jié)果可知,整體模型的P值為0.019 4,相關(guān)系數(shù)為0.851 6,失擬誤差為0.150 2,表明該二次方程模型可以很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn),說(shuō)明這種方法是可靠的[15],使用該方程模擬真實(shí)的四因素三水平的分析是可行的。乙醇濃度對(duì)提取率影響顯著,液料比、提取溫度對(duì)提取率的影響達(dá)到了極顯著,三者的二次項(xiàng)對(duì)苦蕎黃酮提取率的影響也均達(dá)到了極顯著的水平,表明試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,二次項(xiàng)與響應(yīng)值也有很大關(guān)系。在選取的4個(gè)因素水平范圍內(nèi),對(duì)苦蕎籽粒黃酮提取率的影響大小順序?yàn)?提取溫度(C)＞液料比(A)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)＞提取時(shí)間(D)。

本次試驗(yàn)各因素間響應(yīng)面分析圖及等高線見(jiàn)圖5,曲面越陡峭表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[16]。從圖5可以看出液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)總黃酮的得率影響比較大,而提取時(shí)間對(duì)應(yīng)的曲線變化則比較平緩,這和表3的方差分析結(jié)果吻合,液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)應(yīng)的P值均達(dá)到了顯著水平,而提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響則不顯著。Design-Expert 8.0.6軟件分析得4個(gè)因素特征值依次為1,0.493,-0.043,0.037,即苦蕎黃酮的最佳提取條件為液料比20∶1 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)74.96%,提取溫度69.56℃,提取時(shí)間4.04 h,理論較佳提取率為2.606%。

圖5 兩因素交互作用對(duì)總黃酮得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for effects of operating parameters on the extraction rate of total flavonoids

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性,采用實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取條件進(jìn)行苦蕎黃酮浸提的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為方便實(shí)際操作和以后生產(chǎn)將提取條件調(diào)整為:液料比20 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,提取溫度70℃,提取時(shí)間4 h,此時(shí)計(jì)算出的理論提取率為2.606%。表4為重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,5次平行實(shí)驗(yàn)得到的苦蕎黃酮實(shí)際平均提取率為2.632%,RSD值為1.79%,說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型能很好地預(yù)測(cè)各因素與提取率之間的關(guān)系。

表4 響應(yīng)面分析結(jié)果重復(fù)試驗(yàn)Tab.4 Repeated trials of response surface analysis results

2.4 苦蕎籽粒粗黃酮的純化

圖6 AB-8大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解析曲線Fig.6 Static adsorption and desorption curves of AB-8

圖6(a)是5 g AB-8型濕樹(shù)脂對(duì)40 mL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的黃酮溶液進(jìn)行吸附的吸附曲線。由圖6(a)可知,在0到0.5 h,樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附量迅速上升。0.5 h到4 h上升趨勢(shì)較平緩,吸附4 h后樹(shù)脂的吸附量已經(jīng)趨于平衡,達(dá)到平均每克樹(shù)脂吸附24 mg黃酮。圖6(b)為40 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液對(duì)4 g吸附后樹(shù)脂進(jìn)行解析的解析曲線。由圖6(b)可知,AB-8型大孔樹(shù)脂能快速達(dá)到解吸平衡,0.5 h時(shí)解析率高達(dá)80%以上,解析1 h后解析率趨于穩(wěn)定。因此,在對(duì)苦蕎粗黃酮進(jìn)行初步純化時(shí)選定AB-8型大孔樹(shù)脂吸附時(shí)間為4 h,解析時(shí)間為1 h。測(cè)得純化后苦蕎黃酮的純度為76.47%。

2.5 苦蕎籽粒黃酮抗氧化分析

2.5.1 苦蕎籽粒黃酮清除O2-·的能力

圖7為鄰苯三酚自氧化法測(cè)得的不同質(zhì)量濃度苦蕎籽粒黃酮對(duì)O-2·的清除率。由圖7可知,苦蕎籽粒黃酮清除O-2·的能力隨著樣品濃度的增大而增大,在黃酮質(zhì)量濃度為150 μg/mL后清除率呈線性關(guān)系上升。說(shuō)明苦蕎籽粒黃酮對(duì)O-2·有一定的清除效果,通過(guò)擬合方程計(jì)算其IC50值為0.498 mg/mL,高于抗壞血酸的IC50值(0.139 mg/mL),表明苦蕎黃酮對(duì)O-2·的清除能力低于抗壞血酸。

圖7 苦蕎籽粒黃酮超氧離子自由基清除能力Fig.7 Superoxide anion radicals scavenging capabilities of total flavonoids in seed of tartary

2.5.2 苦蕎籽粒黃酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力

圖8是不同質(zhì)量濃度苦蕎籽粒黃酮和抗壞血酸抗大豆卵磷脂過(guò)氧化能力的測(cè)定。由圖8可知,隨著苦蕎籽粒黃酮質(zhì)量濃度的增大,其對(duì)Fe2+引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體過(guò)氧化的抑制作用有明顯的上升趨勢(shì)。黃酮類物質(zhì)通過(guò)與鐵離子進(jìn)行螯合并清除氧化過(guò)程產(chǎn)生的自由基和過(guò)氧化物來(lái)抑制大豆卵磷脂的進(jìn)一步氧化[17],因此苦蕎籽粒黃酮能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力IC50值為1.115 mg/mL,略高于抗壞血酸(IC50值0.693 mg/mL),表明苦蕎黃酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力略低于抗壞血酸。

2.5.3 苦蕎籽粒黃酮的還原力

圖8 苦蕎籽粒黃酮抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力Fig.8 Lipid peroxidation inhibiting capability of total flavonoids in seed tartary

樣品的還原力和抗氧化活性有明顯相關(guān)性[18],苦蕎籽?？傸S酮還原力測(cè)定依據(jù)樣品能夠提供電子的數(shù)目和難易程度,圖9為苦蕎籽粒黃酮和抗壞血酸還原力的測(cè)定結(jié)果。由圖9可知,在一定范圍內(nèi),苦蕎籽粒黃酮的還原力隨著濃度的升高而增大,表明苦蕎籽粒黃酮具有還原力,但其還原力低于抗壞血酸,且隨著二者濃度的升高,還原力差距變大。

圖9 苦蕎籽粒黃酮還原力Fig.9 Reducing abilities of total flavonoids in seed of tartary buckwheat

2.5.4 苦蕎籽粒黃酮清除DPPH自由基的能力

圖10和圖11分別為不同質(zhì)量濃度苦蕎籽粒黃酮和抗壞血酸溶液清除DPPH自由基的能力。由圖10可知,苦蕎籽粒黃酮在30 μg/mL到100 μg/mL隨著黃酮濃度的增大,清除DPPH自由基的能力也增大,之后保持平衡,清除率穩(wěn)定在90%左右。由圖11可知,抗壞血酸為10 μg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率即達(dá)到了90%。因此較高濃度的黃酮溶液(大于100 μg/mL)對(duì)DPPH自由基的清除率接近抗壞血酸。通過(guò)擬合方程計(jì)算的苦蕎籽?？傸S酮清除DPPH自由基的IC50值為2.235 μg/mL,說(shuō)明所提樣品有比較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。

圖10 苦蕎籽粒黃酮清除DPPH自由基能力Fig.10 DPPH scavenging capability of total flavonoids in the seed of tartary buckwheat

圖11 抗壞血酸清除DPPH自由基能力Fig.11 DPPH scavenging capability of ascorbic acids

3 結(jié) 論

用水浴搖床對(duì)苦蕎籽?？傸S酮進(jìn)行了提取,在較好控制溫度的同時(shí)增大了苦蕎粉和溶劑的接觸面積。響應(yīng)面試驗(yàn)得出黃酮的較佳提取條件為:液料比(mL/g)20∶1,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,提取溫度70℃,提取時(shí)間4 h,測(cè)得的實(shí)際提取率為2.632%。其中,溫度對(duì)提取率影響最大,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)說(shuō)明所得結(jié)果可用。所得苦蕎籽粒粗黃酮經(jīng)AB-8型大孔樹(shù)脂吸附純化后的純度達(dá)到76.47%(純化前為36.17%)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究苦蕎籽粒黃酮清除超氧離子自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力、對(duì)Fe3+的還原力及清除DPPH自由基的能力進(jìn)行研究,并用抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明苦蕎籽粒總黃酮具有一定的抗氧化活性,其中對(duì)DPPH自由基的清除能力比較強(qiáng),其IC50值為2.235 μg/mL。樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力與抗壞血酸非常接近,清除O-2·能力和還原力均低于抗壞血酸,二者的差距均隨著濃度的增加而增大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為苦蕎保健品及其他方面的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。

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Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Tartary Buckwheat Seed

LI Fei, REN Qing*, JI Chao, HOU Chang
(School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Response surface methodology was used to optimize the extraction processing of the total flavonoids in the seed of tartary buckwheat according to central composite design principle based on the single factor experimental results.Through the analysis of cross-interaction among factors by the Design-Expert software,the optimal extraction conditions were found to be liquid-material ratio 20∶1,alcohol concentration 75%,extraction temperature 70℃,and extraction time 4h.The extraction rate of flavonoids was 2.632%under the optimal extraction conditions.Meanwhile,the antioxidant activity of total flavonoids was assessed by scavenging hydroxyl radicals and DPPH radical,anti-lipid peroxidation,and reducing power.The results showed that the total flavonoids in the seed of tartary buckwheat presented a strong antioxidant activity to scavenge DPPH radicals and IC50values of anti-lipid peroxidation,scavenge hydroxyl radicals,and DPPH radical were 1.115,0.498,and 2.235 μg/mL.

seed of tartary buckwheat;flavonoids;response surface methodology;antioxidant activity

TS201.4

A

(責(zé)任編輯:檀彩蓮)

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.06.010

2095-6002(2015)06-0057-08

李飛,任清,季超,等.苦蕎籽粒黃酮的提取純化及抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2015,33(6):57-64.

LI Fei,REN Qing,JI Chao,et al.Extraction and antioxidant activity of total flavonoids from tartary buckwheat seed[J].Journal of Food Science and Technology,2015,33(6):57-64.

2015-06-11

國(guó)家燕麥?zhǔn)w麥現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-08-D-3)。

李 飛,女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù);

*任 清,男,副教授,博士,主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。通信作者。