王 平, 余 凡, 黃永吉, 陳勝燁, 經(jīng)艷芬, 鄧祖湖,3

(1.福建農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室，福建 福州 350002；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所瑞麗站，云南 瑞麗 678600；3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004)

染色體計數(shù)法鑒定甘蔗真假熱帶種

王 平1, 余 凡1, 黃永吉1, 陳勝燁1, 經(jīng)艷芬2, 鄧祖湖1,3

(1.福建農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室，福建 福州 350002；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所瑞麗站，云南 瑞麗 678600；3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004)

以甘蔗熱帶種中5個品種的根尖分生區(qū)細胞為研究對象，采用酶解去壁低滲法制片，使用顯微鏡直接觀察法，分別統(tǒng)計染色體條數(shù)，旨在鑒別真假熱帶種。結(jié)果表明，供試材料中羅漢蔗和Badila染色體條數(shù)較為固定，2n=80條，為典型熱帶種；而50uahpele、Muckche和白眉蔗的染色體眾數(shù)分別為86、142和104條，與典型熱帶種(2n=80條)有較大的偏差，由此表明該3個甘蔗品系為假熱帶種。

甘蔗; 熱帶種; 染色體; 品系

甘蔗不僅是重要的糖料作物，也是最有潛力的生物能源作物之一[1]。甘蔗屬有6個原種，包括4個栽培種和2個野生種。栽培種包括熱帶種(Saccharumofficinarum)、中國種(S.sinense)、印度種(S.bareri)和肉質(zhì)花穗野生種(S.edule)；野生種包括大莖野生種(S.robustum)和割手密(S.spontaneum)[2]。其中熱帶種是重要的栽培種之一。熱帶種被稱為高貴種(noble cane)，大莖、葉片寬、含糖量高，在甘蔗育種上是高糖基因及高產(chǎn)基因的種源[3]，是甘蔗高貴化育種的回交親本[4]。所謂高貴化(nobilization)就是以熱帶種為母本、其他野生種為父本，雜交得到的后代再連續(xù)與熱帶種回交的過程[5]。20世紀初，荷蘭育種家Jeswiet首創(chuàng)甘蔗高貴化育種法，選育出了被譽為“一代蔗王”的POJ2878，產(chǎn)量、含糖率、抗性和適應(yīng)性都十分優(yōu)越，是全球甘蔗育種場使用最成功的育種親本，當今絕大部分甘蔗栽培品種含有其血緣[6]。甘蔗真假熱帶種的鑒定對高貴化育種具有重要意義，主要體現(xiàn)在親本選擇方面。多年來，熱帶原種被廣泛應(yīng)用在甘蔗種質(zhì)資源雜交利用中，通過遠緣雜交獲得大批雜交后代[7]，其抗逆性表現(xiàn)差異較大[8]。鑒定品種的方法較多，包括形態(tài)學鑒定和生理指標測定、細胞學鑒定、DNA分子標記、基因組原位雜交等方法。染色體是生物細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體，每個物種都有一定數(shù)目及一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的染色體[9]。典型熱帶種染色體條數(shù)2n=80[10-11]，染色體基數(shù)x=10[12-13]。基于典型熱帶種染色體條數(shù)2n=80這一特征，通過染色體計數(shù)的細胞學方法甄別真假熱帶種直觀有效。

1 材料與方法

1.1 材料

以羅漢蔗、Badila、50uahpele、Muckche和白眉蔗5種甘蔗根尖分生區(qū)細胞中期染色體為材料。其中，Badila來自福建農(nóng)林大學甘蔗綜合研究所；Muckche和羅漢蔗由云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所提供；50uahpele和白眉蔗由云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所瑞麗站提供。所有材料均保育在福建農(nóng)林大學甘蔗綜合研究所資源圃。

1.2 方法

1.2.1 染色體玻片的制備 采用酶解去壁低滲法[6,14]和涂片法[15]制備根尖分生區(qū)細胞染色體玻片。首先使用對二氯苯-α溴萘進行預處理，再用卡諾氏固定液4 ℃固定24 h，清洗干凈后置于37 ℃酶解。酶解時間依據(jù)根的大小而定，一般為3-4 h。酶解前后用0.075 mol·L-1KCl和ddH2O各低滲30 min，涂片后使其自然干燥，并用pH值為6.8的Giemsa染液染色。

1.2.2 細胞染色體觀察 使用Carl Zeiss顯微鏡觀察染色體玻片。每種材料挑選30個染色體清晰且分散良好的中期分裂相細胞，利用AxioVision 4.7軟件拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計染色體條數(shù)。

2 結(jié)果與分析

圖1顯示，5種甘蔗無性系材料的染色體背景比較干凈、形態(tài)完整且分散良好。經(jīng)統(tǒng)計，羅漢蔗和Badila染色體眾數(shù)為：2n=80條(圖1A、1B)，而50uahpele、Muckche和白眉蔗的染色體眾數(shù)2n≠80條，其中50uahapele約86條、Muckche約142條、白眉蔗約104條(圖1C、1D、1E)。本研究表明，Badila和羅漢蔗染色體條數(shù)較為固定，2n=80條，而其他3種材料的染色體2n>80條，且數(shù)目相差較大。在統(tǒng)計過程中，同種材料不同細胞的染色體數(shù)目有所波動(表1)，可能由于酶解或制片過程中出現(xiàn)染色體丟失和重疊的現(xiàn)象，因此需要觀察多個細胞，取眾數(shù)，有助于減小誤差。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)代甘蔗品種具有復雜的基因組結(jié)構(gòu)，典型熱帶種染色體 2n=80條，主要包括拔地拉(Badila)、黑車里本(Cheribon Cane)、克里斯塔琳娜(Cristalina)、奧它希地(Otaheite)等[16]。本研究選用的羅漢蔗和Badila是典型熱帶種，尤其是Badila在甘蔗育種和制糖業(yè)歷史中曾被廣泛利用。我國主要甘蔗產(chǎn)業(yè)基地以Badila作為高貴化育種的起始親本，選育了大批含割手密、大莖野生種和斑茅等野生種質(zhì)血緣的崖城系列親本[17]。Badila具有皮薄、質(zhì)脆、纖維少和甘甜多汁的優(yōu)良特性，使其在制糖業(yè)占有舉足輕重的地位[18]。在實際甘蔗種植產(chǎn)業(yè)中，除了典型熱帶種之外，還存在一些非典型的熱帶種 (即某些種間雜種或有著未知的復雜血緣但分類學上又類似于高貴種的無性系)。Sobhakumari[19]報道，來自新幾內(nèi)亞島的31個熱帶種無性系中，有29個典型熱帶種(2n=80條)，還出現(xiàn)了2個非典型的熱帶種NG 77-56和NG 77-26，它們的染色體條數(shù)分別為：2n=116、2n=70。Piperidis et al[20]通過基因組原位雜交技術(shù)研究甘蔗染色體組成和傳遞行為，結(jié)果表明，在其中5個非典型熱帶種(2n>80條)的染色體中檢測到了割手密的血緣，說明它們屬于雜種，進一步驗證了之前認為超過80條染色體的無性系可能不是純熱帶種的說法[21]。而且這種非典型熱帶種常有86和142條染色體[22]，本研究中50uahapele(2n≈86條)和Muckche(2n≈142條)染色體條數(shù)剛好與其相符，白眉蔗(2n≈104條)染色體條數(shù)也遠遠超過了80。嚴格意義的高貴化是指典型熱帶種與割手密雜交再連續(xù)與熱帶種回交的過程，熱帶種與割手密雜交F1和BC1多以2n+n的方式進行染色體遺傳，但也出現(xiàn)過n+n、n+2n等不同的遺傳方式[23-24]。若將假熱帶種誤當作純正熱帶種作為親本進行雜交，則其雜交后代的染色體數(shù)目會出現(xiàn)較大變異，不利于遺傳規(guī)律的分析。在甘蔗育種實踐中，如用白眉蔗、Muckche、50uahapele這些摻入了其他血緣的假熱帶種當做典型熱帶種作為母本或回交親本，將會延緩高貴化育種進程,而且不利于品種的改良。

品種細胞總數(shù)個染色體數(shù)目條染色體數(shù)目變化范圍條變幅條羅漢蔗302n=80 80 0Badila302n=80 80 050uahapele302n=86 85-88 3Muckche302n=142141-1432白眉蔗302n=104104-1062

本研究通過染色體計數(shù)確定50uahapele、Muckche和白眉蔗是假熱帶種。染色體計數(shù)法可為甘蔗熱帶種的鑒別提供技術(shù)支持，從而為甘蔗高貴化育種雜交親本的選擇提供借鑒，提高育種效率。

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(責任編輯:陳幼玉)

Determination of authenticity ofSaccharumofficinarumclones by chromosome numbers

WANG Ping1, YU Fan1, HUANG Yong-ji1, CHEN Sheng-ye1, JING Yan-fen3, DENG Zu-hu1,2

(1.Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Ruili Breeding Station, Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Ruili, Yunnan 678600, China; 3.Guangxi Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry, Nanning, Guangxi 530004, China)

To determine the authenticity of fiveSaccharumofficinarumclones, fast growing root tip cells were collected. The cells were treated with enzymatic hydrolysis of low permeability, mounted on a glass slide, and observe under a microscope to count the number of metaphase chromosomes. The results showed that the chromosome numbers varied from 80 to 143. Two clones, Luohanzhe and Badila, had 2n=80 chromosomes and were trueS.officinarumspecies. Whereas the chromosome numbers of 50uachapele, Muckche and Baimeizhe were varied with average number of 2n=86, 142 and 104, respectively. The deviation from the typical 2n=80 chromosome number forS.officinarumclearly suggested that these three tropicalSaccharumclones were notS.officinarumclones.

sugarcane;Saccharumofficinarum; chromosome; clone

2015-07-10

國家甘蔗產(chǎn)業(yè)體系專項資金(CARS-20-1-5)；國家科學青年基金(31401440)資助項目。

王平(1989 - )，碩士研究生。研究方向：甘蔗遺傳育種。Email：wangping629357@163.com。通訊作者鄧祖湖(1969-)，研究員，博士。研究方向：甘蔗遺傳育種。Email：dengzuhu@163.com。

S566.1

A

1673-0925(2015)03-0160-04

10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2015.03.004