谷　旭，方鴻滿，時(shí)舒曼，張甲第，吳　哲

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021； 2.武警吉林省總隊(duì)醫(yī)院口腔科，吉林 長(zhǎng)春 130052)

銀杏葉提取物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力的影響

谷旭1，方鴻滿2，時(shí)舒曼1，張甲第1，吳哲1

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021； 2.武警吉林省總隊(duì)醫(yī)院口腔科，吉林 長(zhǎng)春 130052)

目的：探討銀杏葉提取物(GBE)對(duì)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)成脂分化能力的影響，闡明GBE在細(xì)胞水平上對(duì)骨質(zhì)疏松治療及預(yù)防的意義。方法：將50、100、150、200和400 mg·L-1GBE與成脂誘導(dǎo)液加入到已純化的第3代BMMSCs中(50、100、150、200和400 mg·L-1GBE組)，不加藥的BMMSCs為對(duì)照組，共培養(yǎng)7 d，觀察BMMSCs的形態(tài)學(xué)和表面抗原CD44、CD105和CD34的表達(dá)；采用油紅O染色觀察BMMSCs中脂滴形成情況，并對(duì)BMMSCs的成脂能力進(jìn)行定量分析；采用RT-PCR法檢測(cè)BMMSCs中脂肪組織脂肪酸結(jié)合蛋白(AP2)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的亞型(PPAR-γ)mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：形態(tài)學(xué)檢測(cè)，體外培養(yǎng)的原代BMMSCs 3 d后可見細(xì)胞呈梭形，7 d后細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng)，同向排列；表面抗原標(biāo)記物染色，CD44和CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD34呈陰性表達(dá)，證明其為BMMSCs；油紅O染色，約7 d后顯微鏡下見大量脂滴形成，并隨著GBE濃度的增大脂滴數(shù)量減少；與對(duì)照組比較，其他各組BMMSCs的A510值降低(P<0.05)；RT-PCR檢測(cè)，與對(duì)照組比較，其他各組細(xì)胞中AP2和PPAR-γ mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。結(jié)論：GBE在體外可抑制BMMSCs的成脂分化能力，且抑制能力隨著GBE濃度的增高而逐漸增強(qiáng)。

銀杏葉提取物；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成脂分化；骨質(zhì)疏松

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加，導(dǎo)致骨折發(fā)生的一種全身性骨骼疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與骨髓中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的分化有關(guān)聯(lián)，如果BMMSCs過(guò)多地向脂肪細(xì)胞分化，則向成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞數(shù)就相應(yīng)減少，進(jìn)而引起成骨缺陷導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[2]。學(xué)者們一直致力于骨質(zhì)疏松的防治并盡量減小治療過(guò)程中產(chǎn)生的副作用。近年來(lái)，銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract ，GBE)作為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑受到學(xué)者們的關(guān)注[3]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明GBE可促進(jìn)BMMSCs在體外成骨分化，但有關(guān)BMMSCs在GBE作用下成脂分化能力的變化尚未見報(bào)道。本研究旨在探討不同濃度GBE對(duì)BMMSCs成脂分化能力的影響，闡明GBE在細(xì)胞水平上對(duì)骨質(zhì)疏松的治療和預(yù)防意義。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、主要試劑和儀器健康1周齡Wistar大鼠20只，雌雄不限，平均體質(zhì)量(13±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SZXK(遼)2013-0003。國(guó)際通用銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)品(恒凱銀杏制品有限公司，中國(guó))，L-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清、油紅O(Gibco公司，美國(guó))、雙抗、胰蛋白酶、地塞米松、IBMX、吲哚美辛、胰島素和Trizol(Life Technologies公司，美國(guó))；倒置相差顯微鏡、低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))，二氧化碳孵箱(SANYO公司，日本)，平底96孔板、24孔板、6孔板、培養(yǎng)瓶15 mL離心管(Corning公司，美國(guó))，巴氏吸管、PCR試劑盒、酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司，美國(guó))。

1.2GBE的配置稱取0.02 g GBE溶于100 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中，并溶解于10 mL L-DMEM中，分裝成10份，混勻后抽濾配置成銀杏葉提取液置于-20℃保存。

1.3BMMSCs的分離培養(yǎng) 采用全骨髓法：1周齡Wistar大鼠20只以頸椎脫臼法處死后浸泡于75%酒精消毒10 min，于超凈臺(tái)中取出脛骨、股骨和肱骨，用含10%雙抗的PBS沖洗后，剪斷雙側(cè)骨髓端，完全培養(yǎng)基(含15%Gibco胎牛血清和100 IU·mL-1雙抗的L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基)沖洗骨髓腔。收集骨髓混懸液并用巴氏吸管吹打使其混勻，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并放置于37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。24 h后首次換液，以后每2 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿皿底80%后用0.25%胰酶消化，1∶2傳代至培養(yǎng)瓶中并改用血清濃度為10%的完全培養(yǎng)基。

1.4BMMSCs形態(tài)學(xué)觀察及表面抗原鑒定 培養(yǎng)后用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照生長(zhǎng)狀況。將蓋玻片進(jìn)行滅菌預(yù)處理后放置于24孔板中，純化后的第3代細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104mL-1滴到預(yù)處理好的蓋玻片上，2 h后鏡下觀察見細(xì)胞貼壁，追加培養(yǎng)基。待細(xì)胞80%融合后，進(jìn)行CD34、CD44和CD105抗體染色，并在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5油紅O染色檢測(cè)各組BMMSCs的成脂分化能力 取純化后的第3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至每孔1.0×104，加入24孔板。待細(xì)胞融合至90%后分別加入濃度為50、100、150、200和400 mg·L-1GBE并進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，分別為50、100、150、200和400 mg·L-1GBE組，單純加入成脂誘導(dǎo)液的細(xì)胞作為對(duì)照組，7 d后終止培養(yǎng)，加10%多聚甲醛固定30 min，每孔加入500 μL油紅O 染色10 min，用75%酒精漂洗，除去多余的染料，干燥，鏡下觀察拍照。吸光度(A)值檢測(cè)為油紅O檢測(cè)的定量測(cè)定方法，當(dāng)波長(zhǎng)為510 nm時(shí)，油紅O可以較好的吸收。測(cè)定的A值表示BMMSCs成脂分化能力。油紅O染色照相后，棄油紅O染色液，PBS沖洗3次，每孔加入1 mL異丙醇，靜置15 min，混勻，于每孔取出150 μL加入96孔板中，并于510 nm下測(cè)定A值。

1.6RT-PCR法檢測(cè)各組BMMSCs中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)的亞型PPAR-γ和脂肪組織脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein，AP2)mRNA的表達(dá)水平 將50、100、150、200和400 mg·L-1GBE組和對(duì)照組的BMMSCs培養(yǎng)7 d后，使用Trizol從細(xì)胞中提取出總mRNA，并用Nano-Drop分光光度計(jì)測(cè)定mRNA濃度，按照RT-PCR Kit說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測(cè)PPAR-γ和AP2 mRNA的表達(dá)，并通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2　結(jié)　果

2.1BMMSCs的形態(tài)學(xué) 原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后見少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，換液去除懸浮的雜質(zhì)細(xì)胞，可見星形、短梭形的細(xì)胞分散貼壁生長(zhǎng)，3 d后可見細(xì)胞呈放射狀排列，成梭形，見圖1A(插頁(yè)六)。7 d后可見細(xì)胞呈片狀生長(zhǎng)排列緊密，融合度達(dá)90%，呈漩渦狀生長(zhǎng)，同向排列，可見少數(shù)圓形的細(xì)胞或胞體較大且折光率高的細(xì)胞貼附在其中，見圖1B(插頁(yè)六)。

2.2BMMSCs表面抗原鑒定 細(xì)胞表面抗原染色，分離純化后的第3代BMMSCs細(xì)胞表面抗原CD44和CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)，見圖2(插頁(yè)六)。

2.3各組BMMSCs成脂分化能力 成脂誘導(dǎo)7 d后，鏡下觀察各組脂肪細(xì)胞內(nèi)均有橙紅色脂滴形成，大小不等，胞核被擠于一側(cè)。脂滴數(shù)目隨GBE濃度的升高而逐漸減少。見圖3(插頁(yè)六)。

2.4各組BMMSCs的A510值與對(duì)照組(0.133±0.020)比較，50、100、150、200和400 mg·L-1GBE組BMMSCs的A510值(0.112±0.007、0.096±0.003、0.092±0.006、0.084±0.012和0.067±0.001)隨著GBE濃度的升高而降低(P<0.05)，除100與150 mg·L-1GBE組外，其他各組BMMSCs的A510值兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著GBE濃度的升高，BMMSCs的A510值逐漸降低。

2.5各組BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表達(dá)水平各組BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表達(dá)水平隨著GBE濃度的升高而逐漸降低。單因素方差分析，與對(duì)照組比較，其他各組BMMSCs中PPAR-γ、AP2 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1各組BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表達(dá)水平

Tab.1Expression levels of PPAR-γ and AP2 mRNA in BMMSCs in various groups

GroupPPAR-γmRNAAP2mRNAControl1.00±0.021.00±0.08GBE(mg·L-1) 500.77±0.01**0.61±0.09* 1000.45±0.01**0.29±0.02* 1500.31±0.02**0.24±0.04** 2000.17±0.02**0.14±0.01** 4000.09±0.018**0.09±0.02**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3　討　論

研究[4]顯示：骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要機(jī)制是以犧牲成骨為代價(jià)的成脂分化增加，從而導(dǎo)致骨量的降低，骨髓腔中BMMSCs分化形成脂肪細(xì)胞，其在骨質(zhì)疏松發(fā)病及治療中的作用引起了學(xué)者們的關(guān)注。因此尋找一種能夠促進(jìn)BMMSCs向成骨分化、抑制其向成脂分化的藥物來(lái)治療骨質(zhì)疏松及相關(guān)骨疾病是一個(gè)新的研究方向。

Oh等[5]發(fā)現(xiàn)：GBE有刺激成骨細(xì)胞在體外分化和成骨的功能，提示GBE可用于骨質(zhì)疏松的治療。本實(shí)驗(yàn)選擇的是符合國(guó)際通用GBE標(biāo)準(zhǔn)品，按照德國(guó)Schwabe專利工藝生產(chǎn)的EGb761，其中黃酮占24.0%、萜內(nèi)酯占6.0%、白果酸<0.000 5%、原花青素類占7.0%、羧酸類占13.0%、兒茶素類占2.0%、非黃酮苷類占20.0%、高分子化合物占4.0%，其他成分占3.0%[6]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已明確GBE有促進(jìn)BMMSCs向成骨細(xì)胞分化及促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：GBE可以有效抑制BMMSCs向脂肪細(xì)胞的分化，且其抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

BMMSCs的篩選有多種方法[7-12]，本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓細(xì)胞接種法，可減少反復(fù)離心對(duì)細(xì)胞的損傷，更會(huì)較好地保留BMMSCs的生物學(xué)特性，抗原染色[13～14]結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性證明本課題組提取的BMMSCs無(wú)誤。本實(shí)驗(yàn)選用15%完全培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，10%完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)[15]，這樣既有利于縮短培養(yǎng)周期，同時(shí)可保證使細(xì)胞處于良好的狀態(tài)。

PPAR的亞型PPAR-γ屬激素核受體超家族成員，主要在脂肪組織中表達(dá)，是誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的重要因子。AP2是PPAR-γ下游的涉及到脂類儲(chǔ)存并調(diào)節(jié)脂類代謝的靶基因，PPARγ和AP2 mRNA是BMMSCs成脂分化的較特異性的標(biāo)記物，其表達(dá)可直接反映成脂分化情況[16]。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，各濃度GBE組BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表達(dá)水平降低，并呈濃度依賴性，表明GBE可明顯抑制BMMSCs向脂肪細(xì)胞的分化，并與GBE濃度有關(guān)聯(lián)。結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知：GBE對(duì)BMMSCs的分化調(diào)節(jié)有雙向性，在促進(jìn)BMMSCs成骨的同時(shí)又抑制BMMSCs成脂。

有研究[17-19]顯示：BMMSCs中的Wnt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)，抑制脂肪分化轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的表達(dá)。GBE對(duì)BMMSCs分化的雙向性調(diào)節(jié)是否與Wnt信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)，或是與其他信號(hào)通路有關(guān)是下一步實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Ginkgo biloba extract on adipogenic differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells in rats

GU Xu1,FANG Hongman2,SHI Shuman1,ZHANG Jiadi1,WU Zhe1

(1.Department of Prosthodontics,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China；2.Department of Stomatology，Armed Police Military Hospital, Jilin Province,Changchun 130052,China)

Objective To study the effect of Ginkgo biloba extract (GBE) on the adipogenic differentiation ability of the bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs)，and to clarify its significance in treatment and prevention of osteoporosis at the cell level. MethodsThe third generation of BMMSCs were cultured with adipogenic induction solution(control group),and 50,100,150,200, and 400 mg·L-1GBE(50,100,150,200, and 400 mg·L-1GBE groups) for 7 d.The morphology of BMMSCs and the expressions of surface antisgens CD44,CD105, and CD34 were observed;the formation of lipid droplet in the BMMSCs was observed by Oil Red O staining;the quantitative analysis of the adipogenic ability of the BMMSCs was performed;RT-PCR method was used to test the expression levels of fatty acid-binding protein(AP2) and peroxisome proliferator activated receptor-γ(PPAR-γ) mRNA. ResultsThe morphological detection results showed that the BMMSCs were spindle shaped after culturedinvitrofor 3 d ,and grew in whorls and arranged in the same direction after cultured for 7 d.The surface antigens CD44 and CD105 showed positive expression,and CD34 showed negative expression,which proved the BMMSCs were extracted correctly;the Oil red O staining results showed a large of lipid droplets which was seen under microscope,and the number of lipid droplets was reduced with the increasing of the concentrations of GBE; compared with control group,the A510values of the BMMSCs in other groups were decreased(P<0.05).The RT-PCR results showed the expression levels of AP2 and PPAR-γ mRNA were decreasd in other groups compared with control group (P<0.05). Conclusion GBE can inhibit the adipogenic differentiation ability of BMMSCsinvitro,and the inhibitory ability is enhanced with the increasing of GBE concentration.

Ginkgo biloba extract；bone marrow mesenchymal stem cells；adipogenic differentiation；osteoporpsis

1671-587Ⅹ(2015)02-0343-04

10.13481/j.1671-587x.20150227

2014-11-30

吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題 (201215052);吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(20140520051JH)；吉林省發(fā)改委科研項(xiàng)目資助課題(2013C023-5)

谷旭(1983-)，男，吉林省四平市人，主治醫(yī)師，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事口腔修復(fù)和組織工程學(xué)方面的研究。

吳哲，教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel：0431-88796018，E-mail：lcwztt@sina.com.cn)

R914

A