李慧影，馬亞珂，楊　岳，王　虹

·實(shí)驗(yàn)研究·

漢黃芩素上調(diào)小鼠骨髓Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)*

李慧影，馬亞珂，楊岳，王虹

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津300193）

［目的］探討漢黃芩素對小鼠骨髓Lin-細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附關(guān)鍵功能基因表達(dá)的影響。［方法］采用免疫磁珠法分離小鼠骨髓Lin-細(xì)胞，采用CD117作為標(biāo)志進(jìn)行細(xì)胞鑒定。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）芯片技術(shù)研究漢黃芩素對小鼠骨髓Lin-細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響。采用黏附能力測定實(shí)驗(yàn)觀察Lin-細(xì)胞的黏附能力。［結(jié)果］流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，小鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞免疫磁珠分選后CD117的陽性率為93.7%；芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)漢黃芩素明顯上調(diào)Lin-細(xì)胞血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（Pecam1）基因表達(dá)；黏附能力測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見漢黃芩素增強(qiáng)Lin-細(xì)胞的黏附能力。［結(jié)論］免疫磁珠法分離小鼠骨髓Lin-細(xì)胞是一種較為理想的分離方法；漢黃芩素可能通過上調(diào)小鼠骨髓Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)，從而增加Lin-細(xì)胞的黏附能力。

小鼠骨髓Lin-細(xì)胞；漢黃芩素；關(guān)鍵功能基因；黏附能力

骨髓包含不同種類的干祖細(xì)胞，如造血干細(xì)胞（HSCs）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）以及間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）［1］。干細(xì)胞的表面標(biāo)記素有爭議，并且不同部位的細(xì)胞標(biāo)記也不相同［2-6］。

在骨髓，Lin-被認(rèn)為是血液血管干細(xì)胞的基本特征。血液血管干細(xì)胞是一類具有雙向分化潛能的祖細(xì)胞，可以分化成為造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）［7］。同時(shí)還表達(dá)Flk+、Sca-1+、c-kit＋（CD117）的細(xì)胞具有很強(qiáng)的血管再生功能，被稱為EPCs［8-9］，進(jìn)入組織后開始表達(dá)成熟內(nèi)皮標(biāo)志如血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣依黏連蛋白（VE-cadherin）和E-選擇素（E-selectin）。EPCs通過動(dòng)員，歸巢，遷移，分化，增殖，黏附等生物活性作用，促進(jìn)血管新生［10］。近幾年來實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)一些中藥單體能夠有效促進(jìn)離體內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附、趨化和增殖能力，但作用機(jī)制尚不清楚［11-12］?，F(xiàn)階段研究較多且較成熟的是中藥對MSCs的干預(yù)作用［13-14］。

漢黃芩素（wogonin）是一種重要的黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性。本研究觀察了漢黃芩素對小鼠骨髓Lin-細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響，旨在探討漢黃芩素對Lin-細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附能力是否有影響。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器10～12周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠，每只約20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

胎牛血清、胰蛋白酶液（Biological Industries）；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞裂解液、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液、0．5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Solarbio）；Linege Cell Depletion Kit、PE－CD117抗體（Miltenyi Biotec）；High Pure RNA Isolation Ki（tRoche）；TaqManReverse Transcription Rengents、TaqMan?Gene Expression Master Mix、基因芯片（Applied Biosystems）；EGM－2（Lonza Clonetics）；Vitronectin、Gelatin（Sigma）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）；MiniMACS Separator、MS Columns（Miltenyi Biotec）；ABI PRISM 7500（Applied Biosystems）；PCR C1000（BIO－RAD公司）。

1.2方法

1.2.1Lin-細(xì)胞的分離頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，浸泡75%乙醇中消毒10 min，超凈臺中無菌分離雙側(cè)股骨和脛骨，盡量剔除附著的肌肉和脂肪組織。將骨頭浸泡在D-Hank’s中，用D-Hank’s沖洗骨髓，直到?jīng)_洗液澄清為止，通過70 μm的細(xì)胞過濾器將骨髓沖洗液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。以小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞。懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后根據(jù)細(xì)胞數(shù)目計(jì)算出需加入的Linege Cell Depletion試劑的量進(jìn)行磁性標(biāo)記并選擇合適的分選柱。磁性標(biāo)記后，離心棄去上清，用緩沖液［由磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）組成，需提前一天配制］懸浮細(xì)胞。平衡柱子后，底部放陰性收集管，將標(biāo)本細(xì)胞懸液加入柱中，用緩沖液清洗柱子3次（每次緩沖液與細(xì)胞懸液等量），陰性收集管中所得液體即為Lin-細(xì)胞。離心棄上清，用EGM-2全培基懸浮細(xì)胞，放置37℃、5%二氧化碳（CO）2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2Lin-細(xì)胞的鑒定細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶液進(jìn)行消化，300×g下離心10 min收集細(xì)胞，緩沖液洗去胰蛋白酶液。100 μL緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL PE-CD117抗體，2～8℃下避光孵育10 min。加入適量緩沖液洗去未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞儀檢測PE-CD117的表達(dá)。

1.2.3漢黃芩素對Lin-細(xì)胞關(guān)鍵功能基因表達(dá)的影響Lin-細(xì)胞分選出來后，分別向細(xì)胞中加入二甲基亞砜（DMSO）和終濃度為10-5mol/L的漢黃芩素。孵箱中孵育8 h后，采用High Pure RNA Isolation Kit提取總RNA，采用TaqManReverse Transcription Rengents試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（20μL體系），取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板2.5μL，按照TaqManGene Expression Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，測定Lin-細(xì)胞中基因相對表達(dá)量。采用2-ΔΔCt方法對實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析。功能基因的種類、符號及基因名見表1。

1.2.4漢黃芩素對Lin-細(xì)胞黏附能力的影響Lin-細(xì)胞分選出來后，分別向細(xì)胞中加入DMSO和終濃度為10-5mol/L的漢黃芩素。孵箱中孵育24 h后，各組細(xì)胞胰酶消化收集，以濃度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在2.5 μg/mL Vitronectin和0.5%gelatin包被的96孔板內(nèi)，孵育1 h，去除非貼壁細(xì)胞，4%多聚甲醛固定貼壁細(xì)胞，DAPI染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)，取8孔平均值，比較各組藥物對Lin-細(xì)胞黏附能力的影響。

2　結(jié)果

2.1漢黃芩素促進(jìn)Lin-細(xì)胞的黏附能力與空白組比較，漢黃芩素濃度為10-5mol/L時(shí)對Lin-細(xì)胞的黏附能力有促進(jìn)作用（P<0.01），見圖1。

表1　功能基因的種類、符號及基因名

2.2漢黃芩素上調(diào)Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)以芯片技術(shù)研究漢黃芩素對Lin-細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響，研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素上調(diào)Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)7倍左右，見圖2、圖3。

2.3流式鑒定結(jié)果流式分析結(jié)果表明，小鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞免疫磁珠分選后CD117的陽性率為93.7%，見圖4，證實(shí)得到了高純度的Lin-細(xì)胞。

3　討論

Lin-是小鼠造血細(xì)胞常用表型之一，Lineage系列包括 CD3、CD4、CD8、B220、Gr1、Ter119、CD11b及IL-7R。CD3，CD4，CD8是T細(xì)胞的標(biāo)記；B220表達(dá)于B系細(xì)胞；Gr1是粒細(xì)胞的標(biāo)記；Ter119主要表達(dá)在紅細(xì)胞上；CD11b表達(dá)于巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞和活化的淋巴細(xì)胞；L-7R主要表達(dá)于骨髓中未成熟的B細(xì)胞［15］。Lineage系列主要表達(dá)于骨髓成熟細(xì)胞，通過Lineage-分選可去除成熟細(xì)胞。Lin-細(xì)胞同時(shí)還表達(dá)Flk+、Sca-1+、c-kit+的細(xì)胞具有很強(qiáng)的血管再生功能，被稱為EPCs。血液循環(huán)中含有的EPCs不僅能參與形成新的血管，并且能存在于血管新生活躍的部位［16］。EPCs在分化過程中自身分泌細(xì)胞因子，這些因子均能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激其增殖，促進(jìn)血管新生，從而改善缺血心肌的血液供應(yīng)［17-18］。

圖1　漢黃芩素對Lin-細(xì)胞黏附能力的影響

圖2　漢黃芩素對Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)的影響

圖3　漢黃芩素對Lin-細(xì)胞功能基因表達(dá)的影響

圖4　Lin-細(xì)胞表型鑒定

免疫磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)（MACS）是一種集免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、磁力學(xué)等為一體的高度特異性細(xì)胞分選技術(shù)，其高度特異性來自抗體對抗原的特異性識別［19］。研究表明［20］，MACS是分選效率最高的系統(tǒng)，其具有快速、高效、不影響細(xì)胞功能、操作簡便、純度及得率高等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究。而探針法定量PCR技術(shù)由于其準(zhǔn)確性也已在科研領(lǐng)域得到更為廣泛的應(yīng)用。本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)分選出單個(gè)核細(xì)胞后［21-22］，選用了MACS技術(shù)得到高純度的Lin-細(xì)胞，繼而應(yīng)用PCR芯片技術(shù)，篩查藥物對骨髓干/祖細(xì)胞功能基因的影響，將細(xì)胞分選技術(shù)的特異性、定量PCR技術(shù)的準(zhǔn)確性和芯片技術(shù)的高通量相結(jié)合，既保證了細(xì)胞的干/祖細(xì)胞特征，又滿足了PCR芯片技術(shù)對細(xì)胞量的需求，從而達(dá)到篩查藥物作用靶點(diǎn)的目的。

本實(shí)驗(yàn)選擇了38個(gè)與Lin-細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化、動(dòng)員、歸巢、黏附功能相關(guān)的基因見表1，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)在上述基因中漢黃芩素能夠顯著上調(diào)Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)。

Gigant等［23］研究發(fā)現(xiàn)黏附分子及其受體的表達(dá)能夠調(diào)控祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠顯著上調(diào)Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)，而Pecam1是存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板以及白細(xì)胞表面的一種黏附分子，參與和調(diào)節(jié)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及遷移［24］。但是Pecam1的受體及其是否影響祖細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

天然產(chǎn)物漢黃芩素具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤和抗病毒活性等，多數(shù)研究也是從以上幾個(gè)方面開展。也有文獻(xiàn)報(bào)道漢黃芩素對肺腺癌A549細(xì)胞中黏附、遷移相關(guān)基因有影響［25］，但漢黃芩素對干/祖細(xì)胞是否有作用尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道。故筆者用漢黃芩素對Lin-細(xì)胞的功能基因進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠明顯上調(diào)Lin-細(xì)胞的黏附基因Pecam1的表達(dá)。

通過以上研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫磁珠法分離小鼠骨髓Lin-細(xì)胞是一種較為理想的分離方法，漢黃芩素可能通過上調(diào)小鼠骨髓Lin-細(xì)胞Pecam1基因表達(dá)，從而增加Lin-細(xì)胞的黏附能力，因此可以推測漢黃芩素對干/祖細(xì)胞的動(dòng)員、歸巢有影響，但需進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，此研究提示應(yīng)采用更多的細(xì)胞標(biāo)記物研究藥物對EPCs作用及對藥物的載體機(jī)制進(jìn)一步研究。

［1］Chavakis E，Koyanagi M，Dimmeler S.Enhancing the outcome of cell therapy for cardiac repair:progress from bench to bedside and back［J］.Circulation，2010，121（2）:325-335.

［2］Urbich C，Dimmeler S.Endothelial progenitor cells:characterization and role in vascular biology［J］.Circ Res，2004，95（4）:343-353.

［3］Case J，Mead LE，Bessler WK，et al.Human CD34+AC133+ VEGFR-2+cells are not endothelial progenitor cells but distinct，primitive hematopoietic progenitors［J］.Exp Hematol，2007，35（7）:1109-1118.

［4］ Timmermans F，Van HF，De SM，et al.Endothelial outgrowth cells are not derived from CD133+cells or CD45+ hematopoietic precursors［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（7）:1572-1579.

［5］ Hur J，Yoon CH，Kim HS，et al.Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（2）:288-293.

［6］Yoder MC，Ingram DA.Endothelial progenitor cell:ongoing controversy for defining these cells and their role in neoangiogenesis in the murine system［J］.Curr Opin Hematol，2009，16（4）:269-273.

［7］王建，盧光琇.血液血管干細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué):輸血及血液學(xué)分冊，2005，28（1）：24-26.

［8］ Qin GJ，Ii M，Silver M，et al.Functional disruption of α4 integrin mobilizes bone marrow-derived endothelial progenitors and augments ischemic neovascularization［J］.J Exp Med，2006，203（1）:153-163.

［9］楊棟，辛世杰，李鳳賀，等.小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和表面標(biāo)志物鑒定［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40（12）：1063-1066.

［10］Hristov M，Erl W，Weber PC.Endothelial progenitor cells: mobilization，differentiation，and homing［J］.Arterioscler ThrombVasc Biol，2003，23（7）:1185-1189.

［11］李慶雯，南亞昀，姜希娟，等.丹酚酸B對離體內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附、趨化和增殖的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（1）：20-23.

［12］Shi AW，Gu N，Liu XM，et al.Ginsenoside Rg1 enhances endothelial progenitor cell angiogenic potency and prevents senescence in vitro［J］.J Int Med Res，2011，39（4）:1306-1318.

［13］華聲瑜，趙桂峰，李慶雯，等.丹酚酸B預(yù)處理EPCs對AMI大鼠移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后心肌微環(huán)境的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2012，29（2）：117-120.

［14］高青，季紅，胡先同，等.5-氮胞苷聯(lián)合丹酚酸B促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（1）：24-27.

［15］Shochat C，Tal N，Bandapalli OR，et al.Gain-of-function mutations in interleukin-7 receptor-α（IL7R）in childhoodacute lymphoblastic leukemias［J］.J Exp Med，2011，5（5）: 901-908.

［16］Yang JC，Haworth L，Sherry RM，et al.A randomized trial of bevacizumab，an anti-vascular endothelial growth factor antibody，for metastatic renal cancer［J］.N Engl J Med，2003，349（5）:427-434.

［17］李慶雯，譚俊珍，南亞昀，等.丹酚酸B干預(yù)EPCs對BMSCs移植的AMI大鼠心肌VEGF、bFGF蛋白表達(dá)的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2009，26（1）：57-59.

［18］Ya JX，Huang XF，Lv WM，et al.Combination of stromalderived factor-1α and vascular endothelial growth factor gene-modified endothelial progenitor cells is more effective for ischemic neovascularization［J］.Journal of Vascular Surgery，2009，50（3）:608-616.

［19］Berardi AC，Wang A，Levine JD，et al.Functional isolation and characterization of human hematopoietic stem cells［J］. Science，1995，267（5194）:104-108.

［20］Wynter EA，Coutinho LH，Marsh JC，et al.Comparison of purity and enrichment of CD34+cell of bone marrow，umbilical cord and peripheral blood（primed of apheresis）using five separation systems［J］.Stem Cells，1995，13:524-532.

［21］宋春敬，劉曉帆，孫艷明，等.滋腎調(diào)沖法對大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（6）：493-496.

［22］李美玲，劉鳳姣，劉玲.小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定［J］.中國動(dòng)脈硬化雜志，2011，19（6）：465-468.

［23］Gigant C，Latger-Cannard V，Bensoussan D，et al.Quantitative expression of the adhesion receptors VLA-4，VLA-5，L-selectin，MAC-1，and ICAM-1 on the surface of CD34+ cells［J］.Transfus Clin Biol，2001，8（6）:453-459.

［24］Muller WA，Weigl SA，Deng X，et al.PECAM-1 is required for transendothelial migration of leukocytes［J］.J Exp Med，1993，178:449-460.

［25］黃愷飛，黃亦琦.漢黃芩素對肺腺癌A549細(xì)胞黏附和遷移能力的影響及其可能機(jī)制［J］.腫瘤，2011，31（1）：34-38.

Regulated Pecam1 gene expression in bone marrow-derived Lin-cells by wogonin

LI Hui-ying，MA Ya-ke，YANG Yue，WANG Hong
（Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To explore the effects of wogonin on the proliferation，differentiation，migration，adhesion gene expression of bone Marrow-derived Lin-cells.［Method］Using magnetic activated cell sorting（MACS）to separate Lin-cells from bone marrow and using CD117 as a marker for cell identification.To investigate the effect of wogonin on functional gene expression of bone marrow-derived Lin-cells by real-time-RT-PCR array technology.Adhesion method was used to detect the effect of wogonin on the adhesion of Lin-cells.［Result］Flow cytometry results showed that，mononuclear cells derived from bone marrow of mice after MACS，the separation rate of CD117 was 93.7%.The PCR chip results showed that the gene expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1（Pecam1）of Lin-cell was significantly up-regulation by wogonin.The adhesion ability experimental result showed that wogonin could enhance the adhesion ability of Lin-cells.［Conclusion］It is an ideal separation method by using MACS to separate Lin-cells from bone marrow.Wogonin may up regulate Lin-cells in bone marrow of mice Pecam1 gene expression，thereby increasing the adhesion ability of Lin-cells.

bone marrow-derived Lin-cells；wogonin；key functional gene；adhesion ability

R285.5

A

1673－9043（2015）02－0086-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.06

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173592）；新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（NCET-13-0935）；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助（IRT0973）。

李慧影（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療缺血性心臟病，心血管藥理。

王虹，E-mail：wanghongsys@126.com。

（2014-11-14）