陳　聰，印紅愛，喻　嶸，曾　婧，唐　元，羅文娟，張　翔，成細(xì)華

·實(shí)驗(yàn)研究·

左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞podocin及nephrin表達(dá)的影響*

陳聰，印紅愛，喻嶸，曾婧，唐元，羅文娟，張翔，成細(xì)華

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410208）

［目的］探討在高糖作用下，體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞podocin及nephrin表達(dá)水平的變化，及左歸降糖益腎方含藥血漿的調(diào)控作用。［方法］將體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞隨機(jī)分為空白組（A組）、高糖組（B組）、左歸降糖益腎方含藥血漿組（C組）、4-苯基丁酸含藥血漿組（D組）。采用間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定足細(xì)胞podocin及nephrin蛋白的表達(dá)；噻唑藍(lán)（MTT）自動(dòng)比色法檢測足細(xì)胞活力，蛋白質(zhì)印跡法，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法分別檢測podocin及nephrin蛋白或mRNA表達(dá)水平的變化。［結(jié)果］與A組相比，B組足細(xì)胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；與B組相比，C組、D組足細(xì)胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平均升高（P＜0.01）；與C組相比，D組足細(xì)胞活力升高（P＜0.05）。［結(jié)論］podocin及nephrin蛋白或mRNA表達(dá)水平的降低，是足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制之一；左歸降糖益腎方含藥血漿可以通過升高podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平，從而保護(hù)足細(xì)胞。

左歸降糖益腎方；高糖；足細(xì)胞；Podocin；Nephrin

足細(xì)胞位于腎小球基底膜外側(cè)，是終末分化的上皮細(xì)胞，幾乎沒有再生能力，是腎小球?yàn)V過的最后一道屏障。足細(xì)胞的損傷和剝脫，與糖尿病腎?。―N）早期發(fā)病相關(guān)［1-3］。podocin及nephrin是足細(xì)胞裂孔膜跨膜蛋白分子，其結(jié)構(gòu)與功能的改變參與了DN的發(fā)生、發(fā)展［4-5］。高糖環(huán)境是引起足細(xì)胞損傷及（或）死亡的原因之一，其具體分子機(jī)制尚不清楚。左歸降糖益腎方含熟地黃、黃芪、山藥等9味藥，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其可改善糖尿病腎病MKR鼠腎功能，保護(hù)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)［6］。在前期研究基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探討左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的調(diào)控作用和部分可能分子機(jī)制，為糖尿病腎病的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞小鼠足細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞中心（Mouse podocyte；3111C0001CCC000230）。以含10%胎牛血清，90%的DMEM完全培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、25 mmol/L葡萄糖）在細(xì)胞培養(yǎng)室5%二氧化碳（CO2），37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間2～3 d更換培養(yǎng)液1次，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞體積明顯增大，向四周伸出足突分化成熟后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)場地主要由湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2主要試劑總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司，批號DP431。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Fermentas公司，批號#K1622。PCR引物，由上海生工公司合成。Rabbit nephrin antibody購自Abcam公司，批號ab58968。Rabbit podocin antibody購自SANTA公司，批號SC-21009。Mouse GAPDH antibody購自SANTA公司，批號SC-365062。葡萄糖（分析純），購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號10010518。Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZF-0511。

1.1.3主要儀器TG16W型臺式離心機(jī)，購自長沙平凡儀器儀表有限公司。DCW-3510節(jié)能型智能恒溫槽，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。WD-9402 A型PCR擴(kuò)增儀，購自北京六一儀器廠。F1-F2 Fuses Type T2A型化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)，購自Bio-Rad公司。BioPhotometer plus型核酸蛋白分析儀，購自Eppendorf公司。AE 31型倒置熒光顯微鏡，購自Motic公司。

1.1.4含藥血漿制備左歸降糖益腎方：由熟地黃、黃芪、山藥等9味藥組成（中藥湯劑制備：經(jīng)水煎煮2次，混合過濾后，濃縮制備成含生藥濃度為2 g/mL的藥液，經(jīng)滅菌后置4℃冰箱中備用）。君藥熟地黃為玄參科地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）干燥塊根的炮制加工品（酒燉或蒸法），黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院王宇紅教授鑒定均為正品。Wistar大鼠40只，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SYXK（湘）2013-0005。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組10只。采用連續(xù)7 d，3倍量給藥，每日1次。按人與大鼠體表面積換算法計(jì)算給藥量，中藥給藥劑量為30 g/kg，灌胃給藥容量為15mL/kg；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶4-苯基丁酸（4-PBA），生理鹽水稀釋，濃度為0.20 g/mL，劑量為3 g/kg，灌胃給藥容量為15 mL/kg；空白血漿采用相同動(dòng)物不給藥同法收集。末次給藥后1h腹主動(dòng)脈插管取血，EDTA抗凝，收集血漿0.22 μm濾膜過濾，56℃水浴滅活30 min后，分裝置-20℃冰箱備用。

1.2方法用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，然后轉(zhuǎn)種培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基總體積5 mL，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液同步化處理12 h后，分為空白組（A組，10%空白血漿的DMEM培養(yǎng)基，終濃度25 mmol/L葡萄糖），高糖組（B組，含10%空白血漿的DMEM培養(yǎng)基，終濃度200 mmol/L葡萄糖），左歸降糖益腎方含藥血漿組（C組，10%含藥血漿的DMEM培養(yǎng)基，終濃度200 mmol/L葡萄糖），4-PBA含藥血漿組（D組，10%含藥血漿的DMEM培養(yǎng)基，終濃度200 mmol/L葡萄糖）。根據(jù)課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇在48 h后收集細(xì)胞。用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化，離心管收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min，5 min離心，棄上清；用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞沉淀2～3次，1 000 r/min，5 min離心，棄上清；置冰上，用于Western blot，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)等相關(guān)檢測。

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)用總RNA提取試劑盒抽提其總RNA，采用核酸蛋白分析儀測定其濃度。取1 μg總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo（dT）為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參基因。應(yīng)用Primer 5.0軟件，根據(jù)GenBank中小鼠的序列設(shè)計(jì)引物。Podocin：上游5’-TGAGGATGGCGGCTGAGAT-3’，下游5’-GGTTTGGAGGAACTTGGGT-3’，產(chǎn)物大小193 bp。Nephrin：上游5’-CC CAACACTGGAAGAGGTGT-3’，下游5’-CTGGTCGTAGATTCCCCTTG-3’，產(chǎn)物大小211 bp。GAPDH：上游5’-ACTTGAAGGGTGGAGCCAAA-3’；下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACA-3’，產(chǎn)物大小608 bp。選擇最適條件分別對podocin、nephrin、GAPDH進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶灰度值，分別以podocin，nephrin和GAPDH電泳條帶灰度值比值計(jì)算 podocin及nephrin mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2蛋白質(zhì)印跡法按試劑盒操作抽取總蛋白，取出已變性的蛋白樣品。每孔加40 μg蛋白樣品電泳，積層膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜70 min，將轉(zhuǎn)有蛋白的膜置于5%牛血清白蛋白中封閉，37℃，1 h，置于1抗（nephrin、podocin 1抗分別用封閉液1∶500、1∶400稀釋，GAPDH內(nèi)參按照1∶800稀釋）中孵育2h，PBST洗4次，每次10 min，分別加入2抗（1∶40 000或1∶80 000），室溫孵育1 h，PBST洗4次。將膜風(fēng)干，貼在玻璃紙上，加底物，做化學(xué)發(fā)光，得到膠片。將背景較高的底片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，觀察到理想的結(jié)果時(shí)，終止反應(yīng)，用水清洗以去除不需要的背景。GAPDH蛋白為內(nèi)參，目的條帶灰度值/同個(gè)樣品的GAPDH灰度值表示目的基因蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法在無菌狀態(tài)下，將防脫蓋玻片分別放入6孔培養(yǎng)板中。每孔均勻加入含細(xì)胞1×105/mL的完全培養(yǎng)基懸液1mL，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基同步化處理12 h后，分為A組、B組、C組、D組。分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌5min，3次，加入4%多聚甲醛固定（25～30min），PBS洗5～10 min，3次。用1%曲拉通X-100（PBS配制），2～5min，PBS洗5～10min，3次。3%雙氧水（H2O2）配制，室溫孵育10 min，PBS洗5～10 min，3次。分別加入兔抗小鼠 podocin及 nephrin多克隆一抗（1∶100，PBS稀釋），陰性對照以PBS代替一抗，過夜。PBS洗10 min，3次。加入Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶200，PBS稀釋，避光），37℃，40 min，PBS洗10 min，3次。晾干，抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，拍片。

1.2.4噻唑藍(lán)（MTT）自動(dòng)比色法將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約10 000個(gè)，每組各5復(fù)孔，貼壁后，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基，孵育48 h后，終止反應(yīng)，吸除多余培養(yǎng)液，PBS洗2次后，每孔加入含MTT（0.5 mg/mL）的DMEM培養(yǎng)液（不含胎牛血清）150 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)，吸棄廢液，不洗，每孔加入100 μL DMSO，避光置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上570 nm波長檢測各孔吸光值。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析；若不滿足，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果

2.1足細(xì)胞的鑒定細(xì)胞接種12 h后見貼壁，24 h后見細(xì)胞突起長出，2～3 d細(xì)胞可達(dá)80%融合，足細(xì)胞呈星形伸出樹枝狀突起，相鄰細(xì)胞間形成相互連接。免疫熒光染色可見足細(xì)胞特異性蛋白podocin及nephrin表達(dá)陽性。見圖1。

圖1　足細(xì)胞podocin及nephrin蛋白的表達(dá)（免疫熒光染色×400）

2.2檢測結(jié)果與A組相比，B組足細(xì)胞活力，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；與B組相比，C組、D組足細(xì)胞活力，podocin及 nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平均升高（P＜0.01）；與C組比較，D組足細(xì)胞活力升高（P＜0.05），但podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、表2、圖2。

表1　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細(xì)胞活力、podocin及nephrin mRNA表達(dá)水平的影響

表1　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細(xì)胞活力、podocin及nephrin mRNA表達(dá)水平的影響

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，##P＜0.01；與C組比較，△P＜0.05。

組別A B C D n　3 3 3 3 nephrin mRNA/ GAPDH mRNA 0.66±0.05　0.85±0.03　0.61±0.04 0.43±0.01**　0.42±0.01**　0.29±0.08** 0.57±0.01##　0.50±0.01**##　0.45±0.02**##0.64±0.04#△　0.51±0.04**##　0.48±0.01*##A值　podocin mRNA/ GAPDH mRNA

表2　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細(xì)胞podocin及nephrin蛋白表達(dá)水平的影響

表2　左歸降糖益腎方含藥血漿對足細(xì)胞podocin及nephrin蛋白表達(dá)水平的影響

注：與A組比較，**P＜0.01；與B組比較，##P＜0.01。

組別A B C D n 3 3 3 3 podocin/GAPDH　nephrin/GAPDH 0.75±0.03　0.96±0.03 0.33±0.01**　0.42±0.02** 0.53±0.02**##　0.63±0.02**##0.53±0.01**##　0.65±0.02**##

圖2　各組podocin和nephrin蛋白及mRNA的表達(dá)水平

3　討論

足細(xì)胞是糖尿病腎病的關(guān)鍵靶細(xì)胞之一，podocin、nephrin是足細(xì)胞特異性蛋白，是維持足細(xì)胞裂孔膜完整性的重要組成部分，對維持裂孔膜的結(jié)構(gòu)完整與功能、足細(xì)胞正常形態(tài)附著和運(yùn)動(dòng)、介導(dǎo)上皮細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用從而影響腎小球基底膜的通透性和基質(zhì)的沉積等具有重要的作用［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)DN患者足細(xì)胞podocin蛋白或nephrin蛋白表達(dá)降低，且表達(dá)減少與尿蛋白增加負(fù)相關(guān)［6-7］。

相關(guān)研究及本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，nephrin和podocin分布方式相似，主要分布于胞質(zhì)內(nèi)，核膜及胞膜的表面，以胞膜的染色最深；在胞漿呈放射性沿著細(xì)胞骨架分布；且在細(xì)胞膜上呈連續(xù)性的線狀分布［8］。本實(shí)驗(yàn)高糖200 mmol/L體外處理足細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)與空白組葡萄糖組比：足細(xì)胞活力下降，podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。證實(shí)高糖是造成足細(xì)胞損傷的原因之一；足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制之一是podocin蛋白及mRNA的表達(dá)水平降低。左歸降糖益腎方含藥血漿治療后，足細(xì)胞podocin及nephrin蛋白或mRNA表達(dá)水平升高；提示左歸降糖益腎方含藥血漿可以通過升高podocin及nephrin蛋白或mRNA的表達(dá)水平，從而保護(hù)足細(xì)胞。

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Effects of Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma on Podocin and Nephrin expressions in podocyte cells of high glucose condition in vitro

CHEN Cong，YIN Hong-ai，YU Rong，ZENG Jing，TANG Yuan，LUO Wen-juan，ZHANG Xiang，CHENG Xi-hua
（Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

［Objective］To investigate the levels of protein and mRNA expressions of podocin and nephrin in podocyte cells cultured in high glucose condition in vitro，and the effects of Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma on podocin and nephrin expressions in podocyte cells.［Methods］Cultured podocyte cells were divided into four groups：control group（A group），high glucose group（B group），Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma group（C group）and 4-Phenylbutyric acid group（D group）.After incubation for 48 h，the cell viability was detected by MTT colorimetry assay.The protein and mRNA expressions of Podocin and Nephrin were analyzed by western blot or reverse transcription-polymerase chain reaction respectively.［Results］Induced by high g1ucose，the viability of podocyte cells was significantly decreased of B group，and their expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA were downregulated，as compared with A group（P＜0.01）；as compared with B group，the expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA of podocyte cells of C group and D group were upregulated，and the viability of podocyte cells were significantly increased（P＜0.01）；and compared with C group，the cell viability was significantly increased of D group（P＜0.05）.［Conclusion］The lower level expressions of Podocin and Nephrin protein or mRNA were the molecular mechanisms of podocyte injury.ZJYD plasma can repair the damaged podocyte by upregulating Podocin and Nephrin protein or mRNA expressions.

Zuogui Jiangtang Yishen decoction plasma；high glucose；podocyte；Podocin；Nephrin

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0338-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.06

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273753）；湖南省自然科學(xué)基金（12JJ2048，12JJ9031）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2013B321）。

陳聰（1985-），女，博士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治糖尿病腎病的研究。

喻嶸，E-mail:yuron@21cn.com。

（2015-07-15）