桂 娟 ，劉海渤 ，廖琴香 ，徐 旭 ，魯 滌 ，袁 麗

（1.司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國(guó)政法大學(xué) 證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088；3.兵團(tuán)公安局物證鑒定中心，新疆 烏魯木齊 830000）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）是以2～6 bp核心序列為重復(fù)單位的基因片段結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度一般在100～500bp，具有多態(tài)性好、易于擴(kuò)增、易自動(dòng)化檢測(cè)、快捷等優(yōu)點(diǎn)，在群體遺傳學(xué)研究、疾病相關(guān)性研究、法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。本研究應(yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和五色熒光自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)建立15個(gè)基因座熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，并對(duì)新疆維吾爾族群體進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

采集新疆維吾爾族無關(guān)健康個(gè)體血樣299份（均經(jīng)知情同意）。種屬特異性研究選取猩猩、蜘蛛猴、黑猩猩、黑白獼猴、大猩猩、黑冠獼猴、雪貂等DNA（由公安部物證鑒定中心提供），以及兔、羊、豬、犬、貓、鴨、雞、牛、鯽魚等常見動(dòng)物肌肉樣本。同一性研究采集志愿者的血液、口腔拭子、帶毛囊的毛發(fā)樣本。系統(tǒng)靈敏度研究采用9947A樣本。

1.1.2 儀器和試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司），3130遺傳分析儀（美國(guó)AB公司），-86℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司），超純水儀（美國(guó)Millpore公司）。

PCR反應(yīng)緩沖液、ILS500內(nèi)標(biāo)（公安部物證鑒定中心），去離子甲酰胺、POP-4膠（美國(guó)AB公司），Chelex-100（美國(guó) Bio-RAD 公司），0.5 ng/μL 9947A（美國(guó)Promega公司），引物委托上海生工生物有限公司合成，等位基因測(cè)序由北京諾賽生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因座的篩選

經(jīng)文獻(xiàn)篩選及前期遺傳學(xué)調(diào)查，確定13個(gè)常染色體 STR 基因座（D4S2366、D9S925、D3S1744、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470、D18S535、D19S253、D10S1435）、1 個(gè) X 染色體基因座DXS7132和1個(gè)性別基因座Amelogenin。

1.2.2 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

根據(jù)STR基因座等位基因數(shù)目和核心區(qū)域大小安排基因座位置，利用Primer 3軟件重新設(shè)計(jì)引物，并用 BLAST檢測(cè)，分別采用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX熒光素標(biāo)記引物前導(dǎo)鏈5′端，內(nèi)標(biāo)使用ILS500，構(gòu)建五色熒光復(fù)合擴(kuò)增體系。觀察復(fù)合體系擴(kuò)增情況，如出現(xiàn)擴(kuò)增效率不高、非特異性峰、基因座之間距離在10bp以下者，重新設(shè)計(jì)基因座引物。

1.2.3 直接擴(kuò)增法檢測(cè)及引物優(yōu)化

在離心管中配置10 μL直接PCR擴(kuò)增體系，包含：2×MasterMix緩沖液（內(nèi)含 Taq 酶） 5μL，引物 1～5μL，用去離子水補(bǔ)足至10μL。用打孔直徑0.5mm或1.0mm的打孔器打孔，將樣本FTA血卡分別加入離心管，每次電泳設(shè)置9947A陽性對(duì)照。

PCR 熱循環(huán)參數(shù)：72℃ 20min，95℃ 11min；94℃30s，59℃ 2min，72℃ 1min，27 個(gè)循環(huán)；60℃ 60min，25℃保存。在9700型擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

優(yōu)化各基因座引物濃度，最終實(shí)現(xiàn)復(fù)合擴(kuò)增體系中全部基因座的同步擴(kuò)增和各基因座之間的等位基因峰值基本平衡。

1.2.4 復(fù)合擴(kuò)增體系的可行性研究

同一性及穩(wěn)定性檢測(cè)：采集志愿者的血液、口腔拭子、帶毛囊的毛發(fā)。配置PCR反應(yīng)體系，室溫（15～18℃）分別放置 0、12、24、48、72h 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。

系統(tǒng)靈敏度檢測(cè)：在10μL擴(kuò)增體系中分別加入0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08 ng 的 9947A，測(cè)試體系的靈敏度。

種屬特異性檢測(cè)：對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物及常見動(dòng)物的樣本進(jìn)行種屬特異性分析，樣本DNA量為0.4～0.8ng。

1.2.5 等位基因測(cè)序及命名

對(duì)基因座的等位基因測(cè)序，按照重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)進(jìn)行命名[3]。

1.2.6 群體遺傳學(xué)調(diào)查

利用PowerStats v12軟件（美國(guó)Promega公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到13個(gè)常染色體STR基因座在新疆維吾爾族群體中的等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（Ho）、個(gè)體識(shí)別率（DP）、非父排除率（PE）。利用Genepop v4.2軟件對(duì)基因座的基因型頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、期望雜合度（He）、連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）檢驗(yàn)[4]；對(duì) D9S925、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608和D20S470等8個(gè)基因座在新疆維吾爾族人群與西藏藏族[5]、岫巖滿族[6]和廣州漢族[7]之間比對(duì)，進(jìn)行不同群體間的差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 直接擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

在10μL直接擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系中，各基因座引物濃度優(yōu)化結(jié)果為：2.5μmol/L各基因座引物在0.08～0.36μL。15個(gè)基因座均得到有效擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100～330bp，各基因座的等位基因峰均衡性好，且無明顯非特異性峰（圖1）。

圖1 一個(gè)樣本的15個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增體系分型圖譜

2.2 復(fù)合擴(kuò)增體系的可行性檢測(cè)結(jié)果

同一志愿者的血液、口腔拭子、帶毛囊的毛發(fā)各類型樣品得到完整一致的分型；配制好的PCR反應(yīng)體系室溫（15～18℃）放置72h以內(nèi)無差異；本體系靈敏度為0.3 ng；在種屬特異性檢驗(yàn)中，靈長(zhǎng)類動(dòng)物猩猩、大猩猩、黑猩猩可檢出部分等位基因，而蜘蛛猴、黑白獼猴、黑冠獼猴、雪貂、兔、羊、豬、犬、貓、鴨、雞、牛、鯽魚均未檢出特異性峰。

2.3 STR基因座等位基因測(cè)序結(jié)果

根據(jù)基因座等位基因的測(cè)序結(jié)果，按照標(biāo)準(zhǔn)命名法進(jìn)行命名，各基因座的核心序列及遺傳定位見表1。

在299名中國(guó)維吾爾族無關(guān)個(gè)體中，D4S2366、D9S925、D3S1744、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470、D18S535、D19S253、D10S1435和DXS7132基因座在新疆維吾爾族人群中分別檢出等位基因 7、11、9、11、11、13、13、13、11、14、8、9、9 和 8 個(gè)，利用 PowerStats v12 軟件計(jì)算出14個(gè)STR基因座等位基因頻率，結(jié)果見表2。

表1 新疆維吾爾族14個(gè)STR基因座遺傳特征

表2 新疆維吾爾族14個(gè)STR基因座的等位基因頻率 （n=299）

續(xù)表2

2.4 群體遺傳學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.4.1 群體遺傳學(xué)參數(shù)

13個(gè)常染色體STR基因座基因型分布經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，所有基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），PIC 在 0.6970～0.863 5，Ho 在 0.745 8～0.872 9，He在 0.741 1～0.877 7，DP 在 0.888 9～0.969 6，PE在0.502 6～0.740 5，結(jié)果見表3。13個(gè)STR基因座的累積非父排除率和累積個(gè)體識(shí)別率分別為0.999998和0.999999999999。

表3 新疆維吾爾族13個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=299）

2.4.2 連鎖不平衡檢驗(yàn)

經(jīng)LD檢驗(yàn)，13個(gè)常染色體STR基因座不存在連鎖不平衡現(xiàn)象（P＞0.05）。

2.4.3 新疆維吾爾族與其他民族之間的比較

通過群體差異性檢驗(yàn)，新疆維吾爾族8個(gè)基因座等位基因頻率與西藏藏族、岫巖滿族、廣州漢族分別在6、7、8個(gè)基因座上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表 4）。

表4 新疆維吾爾族群體與其他民族比較結(jié)果（P值）

3 討 論

目前，在個(gè)體識(shí)別和親子鑒定案件中主要檢測(cè)常染色體STR基因座，大多案件檢測(cè)20個(gè)以內(nèi)的STR基因座即可滿足鑒定要求，但是一些疑難復(fù)雜的鑒定，如單親、祖孫、同胞、叔侄等案件，往往需要檢測(cè)更多的STR基因座。本研究建立的復(fù)合擴(kuò)增體系包括15個(gè)基因座，常染色體STR基因座和DXS7132基因座均為四核苷酸重復(fù)序列。等位基因命名根據(jù)ISFH[3]在1997年提出的從5′方向閱讀，以5′端第1個(gè)可能包含在重復(fù)序列中的核苷酸為準(zhǔn)來命名STR基因座，并結(jié)合首先公開發(fā)表的優(yōu)先命名原則。

本研究群體調(diào)查采用DNA直接擴(kuò)增法（以下簡(jiǎn)稱“直擴(kuò)法”），將未經(jīng)DNA提取或其他前處理步驟的樣本直接加入到PCR反應(yīng)體系中，以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。直擴(kuò)法減少了檢驗(yàn)步驟，降低了檢驗(yàn)成本，提高了檢驗(yàn)效率，在大量樣本的檢測(cè)中，特別是在數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)中能發(fā)揮重要作用。本研究也驗(yàn)證了利用直擴(kuò)法能得到比較平衡、穩(wěn)定的圖譜。

新疆維吾爾自治區(qū)地處中國(guó)西北，深居亞洲內(nèi)陸，維吾爾族以信仰伊斯蘭教為主，有自己的語言文字，較少同其他民族通婚，可能積累著本民族的祖系基因。本研究通過對(duì)新疆維吾爾族人群進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)13個(gè)常染色體STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），PIC、He、PE、DP 分別在 0.697 0、0.741 1、0.5026和0.8889以上，屬于高識(shí)別率基因座[8]，且影子峰低，利于分型。聯(lián)合13個(gè)STR基因座的累積非父排除率達(dá)0.999998，累積個(gè)體識(shí)別率達(dá)0.999999999999。新疆維吾爾族與西藏藏族、岫巖滿族、廣州漢族在D9S925、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470 基因座上進(jìn)行群體比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。