張卉 楊新杰 秦娜 李曦 楊惠夷 農靖穎 呂嘉林 吳羽華 張權 張新勇 王敬慧 周立娟 張樹才

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是一種受體型酪氨酸激酶，在許多腫瘤中過表達和（或）發(fā)生突變，通過信號轉導控制腫瘤生長，并與新生血管生成、腫瘤的侵襲和轉移關系密切[1]。KRAS基因的突變直接啟動了EGF通路下游的KRAS途徑，并間接啟動了EGF信號通路中的PI3K途徑，使得非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）進展更迅速，并且使針對EGFR上游通路的藥物失效[2]。目前多項研究[3-5]結果表明存在EGFR突變的NSCLC患者應用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）具有較好的臨床療效和安全性，而KRAS基因突變也與肺癌治療的耐藥相關。因此，通過對EGFR和KRAS突變狀態(tài)的檢測，可以篩選出應用EGFR-TKI類藥物治療能夠獲得更多收益的患者。本研究通過檢測分析肺腺癌患者腫瘤組織標本EGFR和KRAS基因的突變狀況，以及其與臨床特征之間的關系，為臨床指導患者進行有針對性的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院2006年1月7日-2014年3月21日收治的初治肺腺癌患者395例，所有患者均經細胞學或組織學證實并有可供檢測的腫瘤組織標本。其中男性211例，女性184例。年齡20歲-82歲；吸煙（吸煙指數(shù)＞20包/年）123例，輕度吸煙（0＜吸煙指數(shù)＜20包/年）57例，不吸煙（吸煙指數(shù)為0）215例；按2002年美國癌癥研究聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer,AJCC）癌癥分期手冊（第6版）NSCLC分期標準，I期52例，II期16例，III期64例，IV期263例（表1）。

1.2 主要儀器與試劑 DNA提取試劑盒（美國Promega公司）；引物、探針合成（廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司）；蛋白酶K（德國Merck公司）；鏈霉親和素-藻紅蛋白、Taq酶和dNTP（美國Invitrogen公司）；DNA聚合酶（美國Promega公司）；微球和Luminex 200TM液相芯片閱讀儀（美國Luminex公司）；PCR儀（美國BIO-RAD公司）；Nanodrop 1000分光光度計（美國Thermo Scientific公司）；低溫離心機（德國Eppendorf公司）。

表1 EGFR與KRAS基因突變亞組分析Tab 1 Subgroup analysis of EGFR and KRAS mutation status

1.3 突變富集液相芯片法 切取5 μm石蠟包埋標本10張，用DNA提取試劑盒從樣本中抽提純化DNA（具體參照產品說明書），隨后用Nanodrop 1000分光光度計對DNA濃度進行定量；所有樣品所提的DNA的量足以用于檢測。取純化后的DNA作為模板進行PCR預擴增，多重PCR反應條件為，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；預擴增產物進行酶切反應，特異切除野生型，反應條件為37 ℃ 30 min；取酶切產物作為模板進行PCR擴增富集突變型，在96 ℃條件下孵育2 min，反應條件為94 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，74 ℃ 2 min，共40個循環(huán)；第二次PCR產物與交聯(lián)了特異探針的微球雜交，雜交反應在96孔板上進行，將PCR產物、微球混合液和雜交液加入反應管中，95 ℃ 5 min，然后60 ℃雜交15 min，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，60 ℃反應5 min[6,7]；于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)。突變分析由益善醫(yī)學檢驗所完成。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，EGFR與KRAS基因突變狀態(tài)和臨床特征分析采用χ2檢驗或Fisher’精確檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 突變檢測結果 395例肺腺癌EGFR基因突變檢測中，有1例檢測失?。?8外顯子G719X突變10例（2.5%）；19外顯子缺失突變93例（23.5%）；20外顯子突變4例（1.0%）；21外顯子突變81例（20.5%）；同時存在兩種突變4例（1.0%）；野生型202例（51.1%）。KRAS基因突變檢測中，有2例檢測失敗；外顯子2突變27例（6.8%）；外顯子3突變2例（0.5%）；野生型364例（92.2%）。同時存在EGFR19外顯子缺失突變合并KARS外顯子2突變1例（0.3%）（表2）。

2.2 突變與臨床特征的關系 女性和不吸煙的患者EGFR基因突變率高于男性和吸煙患者，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001,P＜0.001）；不同年齡、分期及病理取材標本之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與EGFR基因突變不同的是，KRAS基因突變在性別、年齡、分期、吸煙史及病理取材方式各亞組分析中都未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3EGFR與KRAS基因突變相關性分析 在EGFR和KRAS基因都檢測成功的392例患者中，EGFR基因突變陽性患者中有2例（1.0%）同時發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變，而在EGFR基因野生型患者中，有27例（13.5%）發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變。KRAS基因突變在EGFR基因野生型患者中發(fā)生率明顯高于EGFR基因突變患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（表3）。

表2 EGFR及KRAS基因突變檢測結果（n=395）Tab 2 Results of EGFR and KRAS mutation status (n=395)

表3 EGFR基因與KRAS基因突變相關性分析（n=392）Tab 3 Analysis of the correlation between EGFR and KRAS gene mutations (n=392)

3 討論

對于NSCLC患者，選擇合理的治療方案十分重要。美國和中國的腫瘤臨床指南均明確指出使用EGFR-TKI治療前必須進行EGFR基因突變檢測。KRAS是EGFR信號轉導通路下游的一個重要節(jié)點。TKI治療耐藥與KRAS基因突變以及特定的獲得性EGFR基因突變（T790M突變）有關[8]，所以同時檢測KRAS基因突變有助于選擇最能從TKI治療中獲益的患者。

在美國NSCLC患者中只有約10%有EGFR突變，然而在亞洲人中有約30%NSCLC存在EGFR基因突變[3]。Paez等[9]對119例NSCLC患者的EGFR突變進行分析后發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中EGFR基因突變率明顯高于其它病理類型。本研究在對395例肺腺癌腫瘤組織標本檢測中發(fā)現(xiàn)有48.6%患者存在EGFR突變，低于之前IPASS研究[3]中所報道的59.7%的突變率，但與最近PIONEER研究[10]報道的50.2%的EGFR基因突變率接近，原因可能是IPASS研究人群為靶向治療優(yōu)勢人群（女性、腺癌、不吸煙），而PIONEER研究[10]與本研究的研究人群一致，都為確診肺腺癌的患者。本研究中EGFR基因突變率高于之前報道的NSCLC中EGFR基因平均突變率，也說明中國人肺腺癌中EGFR突變率高于其他病理類型。Paez等[9]在進一步的亞組分析中發(fā)現(xiàn)，女性和不吸煙的患者EGFR基因突變率高于男性和吸煙患者。后續(xù)的多項臨床研究[11,12]中，重復證實了女性、不吸煙患者中EGFR突變率明顯高于男性和吸煙患者。本研究中女性、不吸煙患者的EGFR基因突變率也明顯高于男性、吸煙患者（62.0%vs37.1%，61.9%vs30.3%），且差異達到統(tǒng)計學意義（P＜0.001,P＜0.001），與之前的報道結果一致。

KRAS基因突變在非亞洲人群中較為常見。Mao等[13]對22篇論著納入的1,470例肺癌患者進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)231例（16%）患者存在KRAS基因突變，明顯高于國內衣素琴等[14]報道的5.03%和羅煒等[15]報道的3.7%的KRAS突變率。本研究僅對肺腺癌患者進行KRAS突變檢測分析，發(fā)現(xiàn)7.3%的患者存在KRAS基因突變，明顯低于Mao等[13]研究中報告的肺腺癌中26%的KRAS基因突變率，但與國內相關研究報道[14,15]的4.4%-5.3%的KRAS突變率接近。其中差異原因可能是KRAS基因突變也與EGFR基因突變一樣，在不同種族或同一種族不同地區(qū)中存在差異。本研究雖然納入病例數(shù)較多，但主要為北京及周邊地區(qū)患者，具有地域的局限性，因此尚需對多地區(qū)樣本進行檢測分析。目前關于KRAS基因突變與患者吸煙史的相關性報道結果尚不一致。有文獻[16]報道，KRAS基因在吸煙患者中更易發(fā)生。但一項韓國研究[17]中發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與吸煙無關。本研究中也發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與是否吸煙并無相關性（P＞0.05）。另外，與國內多數(shù)報道[14,15,18]結果一致的是，在對性別和年齡的亞組分析中也未發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變存在差異。

大多數(shù)研究[14]認為EGFR和KRAS基因突變是相互排斥的。但在后續(xù)的一些研究中也發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變可以在EGFR基因突變的情況下發(fā)生，但發(fā)生率要明顯低于EGFR基因野生型患者。本研究中檢測到1例患者同時存在EGFR 19外顯子缺失突變和KRAS 2外顯子突變，但臨床應用TKI藥物治療，療效不佳。將EGFR和KRAS基因突變相關性進行分析發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變陽性的患者中KRAS基因突變率為1.0%，而EGFR基因野生型患者中KRAS基因突變率為13.5%，兩者間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。也就是說，KRAS基因突變狀態(tài)與EGFR基因突變狀態(tài)有關，在EGFR基因野生型患者中發(fā)生率更高[19]。

目前尚無任何指南對NSCLC患者的EGFR及KRAS基因突變檢測方法及檢測標本做出明確規(guī)定。但大型國際多中心臨床研究多采用ARMS法進行突變檢測[2-4]。本研究中所采用新型的突變富集液相芯片法，靈敏度可達到0.1%[20]，檢測標本不僅包含手術切除的巨大腫瘤組織標本（173/395），也有支氣管鏡活檢、肺穿刺、胸膜活檢、胸水包埋等臨床常見的微小組織標本（222/395）。結果僅有1例手術標本和2例支氣管鏡活檢標本因石蠟切片中DNA斷裂，導致基因突變檢測失敗。但各類組織標本包括胸水腫瘤細胞沉渣都可以滿足突變富集液相芯片法檢測EGFR和KRAS基因突變的要求，甚至我們在血漿游離DNA的基因突變檢測中也取得了滿意的結果[21]。

肺癌的靶向治療時代已經來臨。初治EGFR基因突變的NSCLC患者中TKI治療有效率雖然達到70%-80%，但還有20%-30%的患者可能因為各種原因存在原發(fā)耐藥，其中KRAS基因突變就是最常見的原因。因此，在NSCLC患者進行TKI藥物治療前進行EGFR和KRAS基因突變檢測是非常必要的，必將成為臨床的常規(guī)診斷項目。