苗瑞婧，張旭，孫迎春，高平

應(yīng)用研究

磷酸化殼聚糖/無(wú)定形磷酸鈣復(fù)合物與多聚磷酸鈉對(duì)脫礦牙本質(zhì)仿生再礦化的影響

苗瑞婧，張旭，孫迎春，高平△

目的 探討磷酸化殼聚糖/無(wú)定形磷酸鈣（P-chi/ACP）與多聚磷酸鈉（TPP）對(duì)脫礦牙本質(zhì)體外仿生再礦化的影響，為深齲再礦化治療提供思路。方法 將32顆中度磨耗的離體磨牙制成大小相同的完全脫礦牙本質(zhì)片32個(gè)，其中2個(gè)樣品用于透射電鏡表征，另30個(gè)分成2組：P-chi/ACP+TPP組（n=15）經(jīng)TPP預(yù)處理后，固定在放置有P-chi/ACP的體外模型上；P-chi/ACP組（n=15）不經(jīng)過(guò)TPP處理。所有樣品根據(jù)是否與P-chi/ACP接觸分為實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)。處理1周后，進(jìn)行顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描定量分析密度變化、透射電子顯微鏡定性分析微觀形態(tài)變化。結(jié)果 顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描結(jié)果顯示P-chi/ACP+TPP組的實(shí)驗(yàn)側(cè)灰度值高于對(duì)照側(cè)（125.42±12.16 vs 96.96±10.56，t= 7.124，P＜0.01），P-chi/ACP組中的實(shí)驗(yàn)側(cè)灰度值高于對(duì)照側(cè)（119.39±8.64 vs 105.27±9.42，t=5.329，P＜0.01）。透射電子顯微鏡顯示P-chi/ACP+TPP組有纖維內(nèi)橫紋樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，提示脫礦牙本質(zhì)片實(shí)現(xiàn)了其主要成分Ⅰ型膠原的分級(jí)化纖維內(nèi)礦化；P-chi/ACP組未見橫紋樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論 單獨(dú)利用P-chi/ACP能夠提高脫礦牙本質(zhì)的密度，但共同利用TPP與P-chi/ACP復(fù)合物才能實(shí)現(xiàn)完全脫礦牙本質(zhì)的仿生再礦化。

牙本質(zhì)；仿生學(xué)；磷酸化殼聚糖；多聚磷酸鈉；再礦化

微創(chuàng)牙科（minimally invasive dentistry，MID）在治療深齲時(shí)往往進(jìn)行間接蓋髓以促進(jìn)軟化牙本質(zhì)的再礦化［1］。傳統(tǒng)的氟化物再礦化方法必須依賴殘余晶體，因此對(duì)于脫礦程度較大的牙本質(zhì)，再礦化效果不夠理想［2］。研究表明，利用聚丙烯酸［3］和多聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）［4］能夠使膠原纖維和部分脫礦牙本質(zhì)再礦化，但目前尚少有研究利用仿生材料對(duì)完全脫礦的牙本質(zhì)進(jìn)行仿生再礦化。本研究利用具有良好生物相容性的磷酸化殼聚糖（phosphorylated chitosan，P-chi），研究新型仿生礦化材料對(duì)不含殘余晶體的完全脫礦牙本質(zhì)的再礦化效果，并利用體外模型模擬深齲結(jié)構(gòu)，探索深齲底部軟化牙本質(zhì)的仿生再礦化治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料 因松動(dòng)拔出的人中度磨耗離體磨牙共32顆（我院口腔頜面外科）。乙二胺四乙酸（EDTA）、殼聚糖、TPP、CaCl2·2H2O、Na2HPO4均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。傅里葉變換紅外光譜儀（MAGNA-560，Nicolet，美國(guó)）、顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描儀（1174-v2，Skyscane，比利時(shí)）、透射電子顯微鏡（JEM-2100F，JEOL，日本）、蠕動(dòng)泵（BT/101S，雷弗，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 脫礦牙本質(zhì)片的制備 將32顆磨牙制成直徑為1 cm、厚度為1 mm的牙本質(zhì)片。在37℃恒溫?fù)u床中，用0.5 mol/L EDTA溶液處理2周做成脫礦牙本質(zhì)片。選取其中2個(gè)樣品進(jìn)行透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）表征。

1.2.2 磷酸化殼聚糖/無(wú)定形磷酸鈣復(fù)合物（P-chi/ACP）的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［5］中的方法制備P-chi，將2.0 g殼聚糖與適量P2O5粉末加入20 mL甲基磷酸中，在0～5℃恒溫環(huán)境下攪拌3 h后，在-20℃冰箱中靜置24 h，取出后用甲醇沉淀，并通過(guò)離心收集，丙醇洗凈，離心3個(gè)循環(huán)后，通風(fēng)櫥下風(fēng)干，得到1.0～1.3 g P-chi。按照60 mmol/L Na2HPO4、50 g/L P-chi、100 mmol/L CaCl2·2H2O的先后順序和濃度配制溶液，攪拌至完全溶解。將孔徑1 cm的多孔板切割為孔高1 mm的模具，利用冷凍干燥技術(shù)制備出直徑1 cm，厚度1 mm的圓盤狀P-chi/ACP復(fù)合物。衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀（attenuated total internal reflectance，ATR-FTIR）、掃描電子顯微鏡及TEM對(duì)P-chi/ACP進(jìn)行表征。

1.2.3 樣品分組 將余下30個(gè)牙本質(zhì)片均分為2組，A組：P-chi/ACP+TPP組；B組：P-chi/ACP組。A組樣品在脫礦處理后，浸泡于25 g/L TPP（pH=9.7）溶液中24 h。B組樣品不進(jìn)行25 g/L TPP處理。ATR-FTIR分別對(duì)2組樣品進(jìn)行表征。

1.2.4 體外再礦化模型的構(gòu)建 建立體外再礦化模型，模擬深齲墊底環(huán)境，用離心管和滴管頂部制成雙層結(jié)構(gòu)，分別模擬窩洞干燥的環(huán)境與牙髓腔的體液循環(huán)環(huán)境。采用蠟固定P-chi/ACP與牙本質(zhì)片。塑料隔離帽中央制備1個(gè)直徑為2 mm的圓孔，模擬牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)，模擬體液通過(guò)蠕動(dòng)泵以10 mL/min的速度在下層循環(huán)，上層干燥，見圖1。采用劉燕等［3］的方法進(jìn)行模擬體液配制。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行1周之后取出樣品。

Fig.1 In vitro model of remineralization圖1 體外深齲模型示意圖

1.2.5 微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（Micro-computed tomography，μCT）檢測(cè) 經(jīng)過(guò)1周的實(shí)驗(yàn)處理后將樣品取出，用μCT對(duì)樣品進(jìn)行非破壞性的三維掃描。利用CT-An軟件（Skyscane）將牙本質(zhì)片的掃描圖像進(jìn)行三維重建、疊加后，分別采集每個(gè)樣品對(duì)照側(cè)與實(shí)驗(yàn)側(cè)的灰度平均值。

1.2.6 TEM檢測(cè) P-chi/ACP支架、2個(gè)脫礦牙本質(zhì)片與實(shí)驗(yàn)處理后的30個(gè)牙本質(zhì)片，經(jīng)過(guò)固定、脫水、包埋和修塊后，切出100 nm厚的透射電鏡制件，于TEM下觀察超微結(jié)構(gòu)，以判斷是否實(shí)現(xiàn)牙本質(zhì)膠原纖維內(nèi)分級(jí)再礦化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，方差齊性，比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙本質(zhì)片的ATR-FTIR檢測(cè)結(jié)果 ATR-FTIR檢測(cè)EDTA脫礦后的牙本質(zhì)片，出現(xiàn)Ⅰ型膠原的特征峰，且未出現(xiàn)磷酸鈣晶體的特征峰，見圖2。牙本質(zhì)片經(jīng)過(guò)25 g/L TPP預(yù)處理后，出現(xiàn)磷酸特征峰，見圖3。提示牙本質(zhì)片經(jīng)過(guò)EDTA處理后為完全脫礦牙本質(zhì)，經(jīng)過(guò)25 g/L TPP處理后完全脫礦牙本質(zhì)片被磷酸化。

Fig.2 ATR-FTIR of dentin demineralized by EDTA圖2 牙本質(zhì)片經(jīng)EDTA脫礦處理后的ATR-FTIR結(jié)果

2.2 P-chi/ACP的ATR-FTIR檢測(cè)結(jié)果與TEM檢測(cè)結(jié)果 ATR-FTIR顯示P-chi/ACP具有PO的特征性波峰，且無(wú)磷酸鈣晶體的尖銳峰，見圖4，提示P-chi/ACP中無(wú)磷酸鈣晶體。TEM圖像顯示P-chi/ ACP的超微結(jié)構(gòu)為納米球形顆粒，見圖5，提示Ca2+與PO離子結(jié)合為非晶相的無(wú)定形磷酸鈣顆粒。

Fig.3 ATR-FTIR of demineralized dentin treated by 25g/L TPP圖3 脫礦牙本質(zhì)片經(jīng)25g/L TPP處理后的ATR-FTIR結(jié)果

Fig.4 ATR-FTIR of P-chi/ACP圖4 P-chi/ACP復(fù)合物的ATR-FTIR結(jié)果

2.3 牙本質(zhì)片μCT檢測(cè)結(jié)果 2組牙本質(zhì)片實(shí)驗(yàn)側(cè)的灰度值均高于對(duì)照側(cè)，見表1。分別從2組中選出1張典型的三維重構(gòu)圖像，以分析灰度值增高的范圍及分布特征，見圖6。用Image J軟件對(duì)圖6中灰度值隨深度的變化趨勢(shì)進(jìn)行繪圖，結(jié)果示2組中實(shí)驗(yàn)側(cè)的灰度值均高于對(duì)照側(cè)，灰度值增高區(qū)域的深度達(dá)到距牙本質(zhì)片上表面0.7 mm以上，且隨著深度增加，灰度值有減小趨勢(shì)，見圖7。

Tab.1 Comparison of grey values of experimental and control sides between two groups表1 2組牙本質(zhì)片實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)的灰度值比較

Fig.6 Three-dimension superimposed image of dentin disks圖6 牙本質(zhì)片縱截面三維重構(gòu)疊加圖像

Fig.7 Image J analysis of reconstructed longitudinal sections of dentin disks圖7 牙本質(zhì)片縱截面三維重構(gòu)圖像Image J分析圖

2.4 EDTA處理后的牙本質(zhì)片TEM檢測(cè)結(jié)果 EDTA處理后的牙本質(zhì)片主要結(jié)構(gòu)為膨松的膠原纖維，見圖8。A組牙本質(zhì)片經(jīng)過(guò)1周再礦化處理后牙本質(zhì)膠原纖維排列致密，膠原纖維內(nèi)具有橫紋樣結(jié)構(gòu)，提示牙本質(zhì)片實(shí)現(xiàn)了其主要成分Ⅰ型膠原的分級(jí)化纖維內(nèi)礦化，見圖9。B組牙本質(zhì)片經(jīng)過(guò)1周再礦化處理后牙本質(zhì)膠原纖維塌陷，條帶不清晰，纖維內(nèi)部?jī)H觀察到窄細(xì)條紋，未出現(xiàn)纖維內(nèi)橫紋樣結(jié)構(gòu)，提示未實(shí)現(xiàn)Ⅰ型膠原的分級(jí)化纖維內(nèi)礦化，見圖10。

3 討論

本研究ATR-FTIR結(jié)果顯示，經(jīng)脫礦處理后牙本質(zhì)的主要成分為Ⅰ型膠原，說(shuō)明牙本質(zhì)片已被完全脫礦，不含無(wú)機(jī)成分及殘余晶體。在掃描參數(shù)一致的條件下，μCT掃描后的三維重建圖像中，灰度值與實(shí)際礦物質(zhì)密度為線性關(guān)系，灰度值越高代表礦物質(zhì)密度越高［6］。本研究μCT掃描結(jié)果顯示，2組實(shí)驗(yàn)側(cè)灰度值均高于對(duì)照側(cè)，提示利用P-chi/ACP可以實(shí)現(xiàn)脫礦牙本質(zhì)片礦物質(zhì)密度的增加。由典型的三維重建圖像分析中可見，2組樣品礦物質(zhì)密度增高區(qū)域的深度可達(dá)到0.7 mm以上，說(shuō)明材料可以透過(guò)表面滲入到牙本質(zhì)片的深層，具有應(yīng)用于深齲底部軟化牙本質(zhì)再礦化治療的潛力。

TEM圖像中顯示P-chi/ACP微觀結(jié)構(gòu)為納米球形顆粒。P-chi是一種多聚電解質(zhì)，能夠?qū)a2+與PO離子包裹形成無(wú)定形的納米磷酸鈣亞穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，成為礦化提供結(jié)晶來(lái)源。研究表明，牙本質(zhì)膠原帶正電荷，具有周期性的結(jié)構(gòu)，有空隙區(qū)和重疊區(qū)，能通過(guò)靜電作用吸引帶負(fù)電的ACP納米球，ACP進(jìn)一步成核、生長(zhǎng)，使牙本質(zhì)膠原實(shí)現(xiàn)再礦化［7］。晶體結(jié)晶理論是指導(dǎo)膠原仿生礦化方法研究的重要基礎(chǔ)理論之一［8］，非經(jīng)典的結(jié)晶理論中，多聚電解質(zhì)將離子穩(wěn)定為無(wú)定形的初始粒子。本研究中的P-chi材料具有將Ca2+與PO離子穩(wěn)定為無(wú)定形磷酸鈣的粒子，是牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白 1（dentin matrix protein，DMP1）的仿生物，與Dai等［9］利用聚丙烯酸（PAA）將Ca2+與PO組裝成了無(wú)定形納米磷酸鈣，從而礦化膠原組織的研究結(jié)果一致。

2 組樣品經(jīng)處理后的礦物質(zhì)密度均有所增加，微觀結(jié)構(gòu)也有所差異。TEM圖像中，A組出現(xiàn)纖維內(nèi)橫紋樣結(jié)構(gòu)，B組膠原纖維塌陷，說(shuō)明A組樣品的超微結(jié)構(gòu)更接近于自然礦化組織，與Tay等［10］的研究結(jié)果一致。牙本質(zhì)的再礦化不僅在于密度的增加，更重要的是要實(shí)現(xiàn)接近自然礦化組織的分級(jí)結(jié)構(gòu)，從而提高其機(jī)械性能，因此A組較B組更好地實(shí)現(xiàn)了仿生再礦化。

推測(cè)在TPP的作用下，2組礦化的機(jī)制不同。A組樣品在TPP堿性溶液處理的條件下，膠原表面的氨基酸缺乏正電荷，與帶負(fù)電荷的ACP粒子不能主動(dòng)相互吸引。A組中完全脫礦的牙本質(zhì)片在經(jīng)過(guò)TPP處理后，ATR-FTIR結(jié)果顯示出現(xiàn)PO3/P-O-P的特征峰，說(shuō)明牙本質(zhì)膠原發(fā)生了磷酸化。研究表明，TPP能夠與膠原分子中空隙區(qū)的氨基酸離子交聯(lián)，有利于進(jìn)一步螯合ACP納米球中的鈣離子，最終形成纖維內(nèi)的分級(jí)再礦化［11］。未經(jīng)TPP處理的膠原纖維中，隨著ACP納米球的不斷沉積，靜電勢(shì)能逐漸縮小，在空隙區(qū)和重疊區(qū)的每個(gè)礦化帶微晶分布逐漸均勻，形成的分級(jí)結(jié)構(gòu)不明顯［9］。

以往研究多采用部分脫礦的牙本質(zhì)、Ⅰ型膠原凍干粉，本研究樣品來(lái)自人離體磨牙，更接近于向臨床醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化。深齲墊底再礦化的體外模型的建立，可應(yīng)用于更多的牙本質(zhì)再礦化體外研究與深齲治療的實(shí)驗(yàn)研究。本研究中采用的P-chi生物相容性較好，已廣泛使用于醫(yī)藥研究，較以往使用較多的PAA具有更良好的生物相容性。雖然P-chi/ACP復(fù)合物尚不能直接應(yīng)用于臨床，但本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)完全脫礦的牙本質(zhì)膠原能夠在P-chi/ACP支架的作用下實(shí)現(xiàn)礦物質(zhì)含量的增加和纖維內(nèi)的分級(jí)再礦化，但其缺點(diǎn)為不易保持形態(tài)穩(wěn)定，今后的研究可以致力于提高材料的親水性及耐久性，并能建立ACP納米顆粒的緩釋系統(tǒng)。

（圖5、8～10見插頁(yè)）

［1］Momoi Y，Hayashi M，F(xiàn)ujitani M，et al.Clinical guidelines for treating caries in adults following a minimal intervention policy—Evidence and consensus based report［J］.J Dent，2012，40（2）:95-105.doi:10.1016/j.jdent.2011.10.011.

［2］Ten Cate JM.Remineralization of deep enamel dentine caries lesions［J］.Aust Dent J，2008，53（3）:281-285.doi:10.1111/j.1834-7819.2008.00063.x.

［3］Liu Y，Mai S，Li N，et al.Differences between top-down and bottom-up approaches in mineralizing thick，partially demineralized collagen scaffolds［J］.Acta Biomater，2011，7（4）:1742-1751.doi: 10.1016/j.actbio.2010.11.028.

［4］Liu Y，Kim YK，Dai L，et al.Hierarchical and non-hierarchical mineralisation of collagen［J］.Biomaterials，2011，32（5）:1291-1300.doi: 10.1016/j.biomaterials.2010.10.018.

［5］Zhang X，Neoh KG，Lin CC，et al.Biomimetic deposition of calcium phosphate minerals on the surface of partially demineralized dentine modified with phosphorylated chitosan［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2011，98（1）:150-159.doi:10.1002/jbm.b.31844

［6］Nazarian A，Snyder BD，Zurakowski，D，et al.Quantitative microcomputed tomography:a non-invasive method to assess equivalent bone mineral density［J］.Bone，2008，43（2）:302-311.doi:10.1016/j.bone.2008.04.009.

［7］Xie BQ，Halter TJ，Borah BM，et al.Tracking amorphous precursor formation and transformation during induction stages of nucleation［J］.Cryst Growth Des，2014，14（4）:1659-1665.doi:10.1021/cg401777x.

［8］Niederberger M，C?lfen H.Oriented attachment and mesocrystals:nonclassical crystallization mechanisms based on nanoparticle assembly［J］.Phys Chem Chem Phys，2006，8（28）:3271-3287.doi:10.1039/ B604589H.

［9］Dai L，Qi YP，Niu LN，et al.Inorganic-organic nanocomposite assembly using collagen as template and sodium tripolyphosphate as a biomimetic analog of matrix phosphoprotein［J］.Cryst Growth Des，2011，11（8）:3504-3511.doi:10.1021/cg200663v.

［10］Tay FR，Pashley DH.Guided tissue remineralisation of partially demineralised human dentine［J］.Biomaterials，2008，29（8）:1127-1137.doi:10.1016/j.biomaterials.2007.11.001.

［11］Niu LN，Zhang W，Pashley DH，et al.Biomimetic remineralization of dentin［J］.Dent Mater，2014，30（1）:77-96.doi:10.1016/j.dental.2013.07.013.

（2014-11-20收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 閆娟）

In vitro biomimetic remineralization of dentin collagen by phosphorylated chitosan/amorphous calcium phosphate compound and tripolyphosphate

MIAO Ruijing，ZHANG Xu，SUN Yingchun，GAO Ping△
Stomatological Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：Gaoping@tmu.edu.cn

Objective To investigate the remineralizing therapy of deep caries and in vitro biomimetic remineralization of demineralized dentin by phosphorylated chitosan/amorphous calcium phosphate compound（P-chi/ACP）and tripolyphosphate（TPP）.Methods Thirty-two extracted human molars were cut and completely demineralized.Two samples were used to show the characteristics by transmission electron microscopy（TEM）.The other 30 samples were divided into two groups: fifteen samples were treated by P-chi/ACP and TPP（P-chi/ACP+TPP group），the other fifteen samples were not treated by TPP（P-chi/ACP group）.All of the samples were distinguished into experimental side and control side，and then they were set on the in vitro model for 1 week.Micro-computed tomography（μCT）and TEM were used to assess the effects of remineralization.Results μCT detection revealed that the mineral density were higher in the experimental sides（125.42±12.16 and 119.39±8.64）than that of control sides（96.96±10.56 and 105.27±9.42）in both groups（P＜0.01）.TEM figures showed that hierarchical intrafibrillar remineralization was realized in samples of P-chi/ACP+TPP group，while trace amounts of hierarchical remineralization was detected in P-chi/ACP group.Conclusion Fully demineralized dentin appears to have the potential to be remineralized with the application of P-chi/ACP.The ultrastructure of samples is better in P-chi/ACP+TPP group than that of P-chi/ACP group.

dentin；bionics；phosphorylated chitosan；sodium tripolyphosphate；remineralization

R781.1；R318.08

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.019

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81200817）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目（12JCQNJC09200）

天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院（郵編300070）

苗瑞婧（1989），女，碩士在讀，主要從事口腔材料研究

△E-mail：Gaoping@tmu.edu.cn