孫航,毛明光,蔣潔蘭,姜志強,李幸,溫施慧

(大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

太平洋鱈ATG5基因的克隆及表達分析

孫航,毛明光,蔣潔蘭,姜志強,李幸,溫施慧

(大連海洋大學農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023)

ATG5(Autophagy related gene 5)基因是一種自噬相關基因,是形成自噬體的重要基因,ATG5基因的表達對自噬調控的成熟有重要作用。本研究中通過克隆,首次得到太平洋鱈Gadusmacrocephalus ATG5 cDNA部分序列,該序列長為895 bp,含有完整的開放閱讀框 (Open reading frame,ORF),編碼275個氨基酸,其編碼的蛋白質相對分子量約為32 200;經核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn),太平洋鱈ATG5核苷酸序列與半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus ATG5核苷酸序列的相似性均高達87.27%;利用太平洋鱈與其他物種ATG5核苷酸序列構建系統(tǒng)進化樹,結果顯示,ATG5核苷酸序列系統(tǒng)進化樹反映的親緣關系基本符合傳統(tǒng)分類學觀點;氨基酸序列分析結果顯示,ATG5蛋白氨基酸序列具有較高的保守性;利用絕對熒光定量PCR方法對ATG5基因在太平洋鱈各組織中的轉錄水平進行檢測,結果顯示,肝、脾和腎中的表達量高于其他組織,鰓、腎、脾、腦、肝和肌肉各組織中的 ATG5 mRNA拷貝數分別為11.617 08、20.449 25、19.706 87、4.839 84、27.434 97、2.954 75 copies/ng。本研究結果將為進一步研究太平洋鱈細胞吞噬機制奠定基礎,也為太平洋鱈的免疫機理和相關研究提供基礎數據。

太平洋鱈;ATG5基因;克隆;絕對熒光定量;表達分析

自噬 (autophagy)是細胞內一項重要的降解機制,通過自噬可將胞內衰老蛋白質運送至溶酶體進行降解[1]。研究發(fā)現(xiàn),自噬在神經退化性疾病、腫瘤、病原體感染過程中發(fā)揮很大的作用,并能對外源性底物 (如病毒)進行吞噬,運送至溶酶體將其溶解,在沒有任何異常蛋白質存在時,失去了自噬作用也會導致疾病發(fā)生[2-3]。自噬體的形成主要由自噬基因 (autophagy-related gene,ATG)的產物ATG分子介導。Matsuura等于1997年發(fā)現(xiàn)了第一個ATG基因[4]。Mizushima等[5]首先鑒定出哺乳動物的自噬基因ATG5和ATG12。自噬體的形成主要通過ATG12-ATG5和ATG8-PE兩個泛素樣連接系統(tǒng)介導[6]。在酵母和哺乳動物細胞中去除ATG5能有效阻滯自噬,表明ATG5在自噬體形成過程中有重要作用[7-8]。目前關于ATG5基因的研究主要集中在哺乳動物,有關魚類ATG5基因的研究報道較少,僅見斑馬魚Danio rerio、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus等,對鱈科魚類未曾涉及。

太平洋鱈Gadusmacrocephalus又名大頭鱈,隸屬于鱈形目、鱈科、鱈屬,屬于冷水性魚類,多生活于海洋底層和深海中下層。太平洋鱈分布于太平洋北部沿岸海域,從北太平洋西南部的黃海,經韓國至白令海峽和阿留申群島一帶沿海,中國太平洋鱈主要產于黃海,是世界重要海洋經濟魚類之一[9-10]。近年來,隨著中國海洋捕撈業(yè)的發(fā)展,近海太平洋鱈的自然資源日益減少,人工繁殖技術問題亟待解決。

目前,本實驗室研究人員在太平洋鱈人工繁育技術方面已取得突破,成功進行了人工繁育和周年飼養(yǎng)。但由于對太平洋鱈免疫系統(tǒng)作用機理尚不清楚,在實際生產中常遇到因病大量死亡的狀況,因此,了解太平洋鱈免疫相關基因的作用特點及表達特性具有重要意義。本研究中,從已獲得的太平洋鱈轉錄組信息中得到了ATG5部分基因信息,通過基因克隆,首次獲得包含完整開放閱讀框 (ORF)的太平洋鱈ATG5 cDNA序列,并用絕對熒光定量PCR方法研究了ATG5基因在不同組織中的表達水平,旨在為了解太平洋鱈的免疫功能提供理論依據,為工廠化養(yǎng)殖提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚太平洋鱈采自大連市旅順口區(qū)附近海域,捕取的野生成魚共3尾 (2雌1雄),平均體質量為2.438 kg,均已性成熟。

LA Taq聚合酶、大腸桿菌 Escherichia coli DH5α菌株感受態(tài)細胞、pMDTM18-T載體、DNA酶I(無RNA酶)和反轉錄試劑盒 (PrimerScriptTMRT-PCR kit)購于大連TaKaRa生物公司;動物組織總RNA提取試劑盒 (DP431)購于天根生化科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒 (QIAquick Gel Extraction Kit)購于QIAGEN公司;質粒提取試劑盒 (EasyPure Plasmid MiniPrep Kit)、2×EasyTaq PCR superMix和Green Two-Step qRT-PCR Super-Mix試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將試驗魚于10℃海水中暫養(yǎng)一周,無異常后進行解剖,分別取3尾魚的鰓、肝、腎、肌肉、脾、腦組織各50 mg于超低溫冰箱(-80℃)中保存待用,且每組設一個平行。

1.2.2 太平洋鱈各組織總RNA的提取及反轉錄對太平洋鱈各組織和仔魚進行總RNA提取,提取方法參照動物組織總RNA提取試劑盒說明書。取4μL總RNA,用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳,取2μL總RNA,用微量核酸測定儀 (NV3000 Spectrophtometer)測定 RNA的 OD值,OD比值在1.9～2.1范圍內的 RNA選為可用 RNA。按照PrimerScriptTMRT-PCR kit說明書,以10μL體系對500 ng總RNA進行反轉錄反應。

1.2.3 目的基因的擴增及序列測定 根據本實驗室太平洋鱈轉錄組信息中已獲得的ATG5基因部分cDNA序列設計引物,如表1所示,應用ATG5-F和ATG5-R引物進行PCR擴增。PCR反應程序: 95℃下預變性5 min;94℃變性30 s,58℃下退火30 s,72℃下延伸1 min,共進行35個循環(huán);最后在72℃再延伸10 min。擴增產物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,經純化后克隆至pMD18-T載體中,將該重組質粒命名為pMD18-Atg5,再轉化至大腸桿菌DH5α中,將陽性克隆送至英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。

1.2.4 基因序列的生物信息學分析 使用NCBI網站的 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.izov/ Blast.cta)工具對cDNA序列進行同源性比對和相似性分析;使用DNAMan 5.0和DNAssist 2.0軟件對cDNA序列進行推導,得到氨基酸序列并推斷其分子量;采用DNAMan 5.0軟件進行氨基酸序列比對;使用Seaview軟件,以鄰位相連法構建系統(tǒng)進化樹。

表1 試驗所用引物[11]Tab.1 Primers used in this experiment[11]

1.2.5 絕對熒光定量PCR檢測ATG5基因在太平洋鱈各組織中的表達

(1)標準曲線的建立。以pMD18-Atg5為模板按照質粒提取試劑盒說明書提取質粒。用微量核酸測定儀測定質粒濃度及純度,并依據公式[12]:計算出質粒的拷貝數。將標準質粒用雙蒸水稀釋成1010～102copies/μL 9個梯度,選取106、105、104、103、102等 5個梯度作為模板,以 ATG5-F′和ATG5-R′為特異引物 (表1),進行熒光定量PCR反應,每個反應設置3個重復。反應在7500 Real Time PCR System上進行,試驗操作根據 Green Two-Step qRT-PCR SuperMix熒光定量PCR試劑盒說明書進行,反應體系為20μL。

反應程序為:95℃下預變性30 s;95℃下變性5 s,57℃下退火15 s,72℃下延伸10 s,共進行45個循環(huán);55℃下反應30 s,每30 s升溫0.5℃,共進行81個循環(huán)達到95℃。反應結束后對擴增曲線和熔解曲線進行分析,制作標準曲線。

(2)絕對熒光定量PCR。分別以太平洋鱈鰓、肝、腎、肌肉、脾和腦各組織的cDNA為未知樣品模板,根據上述反應體系進行絕對熒光定量PCR。反應結束后根據標準曲線計算得到各組織中ATG5基因的精確拷貝數,并使用Excel 2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 各組織總RNA的提取

提取各組織的總RNA后,進行10 g/L瓊脂糖凝膠-TAE電泳鑒定,并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。結果顯示,本試驗中擴增出了所需的特異性片段,條帶清晰。所得RNA的OD值均在1.9～2.1之間,各組織中RNA的平均濃度為:鰓452.81 ng/μL,肌肉106.26 ng/μL,脾351.47 ng/μL,腦269.11 ng/μL,肝817.92 ng/μL,腎354.63 ng/μL。這表明,試驗RNA提取結果良好,達到了預期效果。

2.2 ATG5 cDNA序列的克隆與分析

PCR擴增后,經測序和拼接,獲得了ATG5基因部分 cDNA序列,長度為 895 bp,含有完整ORF,共編碼275個氨基酸,編碼的蛋白質相對分子量約為32 200。根據已獲得的ATG5 cDNA序列,推導其對應的氨基酸序列如圖1所示。

圖1 太平洋鱈ATG5 cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced am ino acid sequence of ATG5 cDNA in Pacific cod Gadusmacrocephalus

2.3 系統(tǒng)進化樹

BlAST比對結果顯示:太平洋鱈與尼羅羅非魚和半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis ATG5核苷酸序列相似性最高,均為87.27%,與人Homo sapiens和鼠Musmusculus的ATG5核苷酸序列相似性分別為78.55%和77.82%;與爪蟾Xenopus laevis ATG5核苷酸序列相似性最低,為68.95% (表2)。根據太平洋鱈及其他幾種動物的ATG5核苷酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果顯示,太平洋鱈與紅鰭東方鲀Takifugu rubripes、半滑舌鰨、亞馬遜花鳉 Poecilia formosa、尼羅羅非魚、紅麗魚Pundamilia nyererei、三刺魚Gasterosteus aculeatus和斑馬魚等聚為一個分支,而爪蟾、雞、豬、鼠、人聚為另一個分支(圖2)。

2.4 物種間ATG5蛋白氨基酸序列的比對

利用DNAMan 5.0軟件將太平洋鱈ATG5蛋白氨基酸序列與尼羅羅非魚、紅鰭東方鲀、斑馬魚、人和鼠ATG5蛋白氨基酸進行比對,結果顯示,ATG5蛋白氨基酸序列的保守性比較強。太平洋鱈ATG5氨基酸序列中含有8個與尼羅羅非魚、紅鰭東方鲀、斑馬魚、人和鼠均不同的氨基酸位點。

表2 太平洋鱈與已知脊椎動物ATG5 cDNA序列的相似性比較Tab.2 Homology analysis of ATG5 cDNA sequence between Pacific cod Gadusmacrocephalus and registered other vertebrates

圖2 基于脊椎動物ATG5核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree derived from multiple alignments of ATG5 nucleotide sequences from vertebrates

2.5 ATG5基因的組織表達

2.5.1 標準曲線的建立 多次重復的PCR產物熔解曲線分析表明,太平洋鱈ATG5基因在設計引物擴增下的溶解曲線呈較為銳利的單一峰,無引物二聚體或其他雜峰,擴增ATG5基因的熔解溫度在85℃左右,且重復性較好,可以用于熒光實時定量分析ATG5基因的轉錄水平。圖4所得的標準曲線為y=-2.8646x+31.389,其中y為CT值,x為起始的模板數量,回歸系數R2=0.9979,這表明標準質粒在稀釋的濃度范圍內具有良好的線性關系。

圖3 物種間ATG5蛋白氨基酸序列的比較Fig.3 The am ino acid sequences in multiple alignments of ATG5 protein among species

圖4 ATG5基因的標準曲線Fig.4 Standard curve of ATG5 gene

2.5.2 ATG5基因的組織表達 從圖 5可見: ATG5基因的轉錄在太平洋鱈各組織中均有表達,其中在肝中表達量最多,顯著高于其他各組織(P＜0.05);在腎和脾中表達量次之,均顯著高于鰓、腦和肌肉組織 (P＜0.05);在腦和肌肉中表達量較少,顯著低于其他各組織 (P＜0.05)。

3 討論

細胞自噬是指將細胞內雙層膜結構包裹的受損物質運輸到溶酶體進行降解的過程,與自噬相關的特異性基因統(tǒng)一命名為ATG[13]。其中ATG5蛋白能夠通過共價鍵與ATG12和ATG16L相連接形成ATG16L-ATG12-ATG5復合物,參與自噬體的形成,在自噬過程中產生重要作用[14]。因此,對太平洋鱈ATG5基因的了解可以為日后的產業(yè)化養(yǎng)殖太平洋鱈的生長發(fā)育和疾病防治提供參考。

圖5 ATG5基因在太平洋鱈各組織中的絕對定量表達Fig.5 Absolute quantitative expression analysis of ATG5 gene in different tissues of Pacific cod Gadusmacrocephalus

本研究中,首次在太平洋鱈中克隆得到了ATG5基因部分cDNA序列,包括完整的ORF,該序列長895 bp,編碼275個氨基酸,所獲得基因經NCBI中BLAST比較,其cDNA序列和其他物種具有較高的一致性,與尼羅羅非魚和半滑舌鰨ATG5 cDNA相似性最高,均為87.27%;與人和鼠相似性分別為78.55%和77.82%;與爪蟾ATG5相似性最低,為68.95%,這些結果進一步確認了本研究中所獲得的cDNA序列為太平洋鱈ATG5基因cDNA序列。氨基酸序列分析結果顯示,該序列具有較高的保守性。系統(tǒng)進化發(fā)育樹反映了相應物種親緣關系的遠近,太平洋鱈與其他魚類聚為一支,人、鼠、豬、雞、爪蛙聚為另一支 (圖2),而太平洋鱈與其他魚類均屬于魚綱,而人、鼠、豬屬于哺乳綱,雞屬于鳥綱,爪蛙屬于兩棲綱,因此, ATG5核苷酸序列系統(tǒng)進化樹反映的親緣關系基本符合傳統(tǒng)分類學觀點。在魚類分支中,太平洋鱈ATG5單獨為一支,與其他魚種親緣關系較遠,差異較大,可能是由于太平洋鱈的分類地位與其他魚類的分類地位具有差異:太平洋鱈屬于鱈形目、鱈科,與鰈形目 (半滑舌鰨)、鱸形目 (紅麗魚、尼羅羅非魚)和鲀形目 (紅旗東方鲀)的分類地位較接近,差異較小,與鯉形目 (斑馬魚)分類地位較遠,差異較大。氨基酸序列比對結果顯示 (圖3),太平洋鱈ATG5蛋白氨基酸序列中存在8個特異位點,這可能是由于太平洋鱈屬深海魚類,多生活于冷水中,而尼羅羅非魚、斑馬魚和紅鰭東方鲀屬于暖溫性魚類,因此,在長期進化過程中,這8個氨基酸位點發(fā)生了變異。

現(xiàn)階段對于ATG5基因的研究主要集中在細胞[15-16]以及胚胎[17-19]和生長各階段的表達[20], 對各組織中的差異表達研究較少。本試驗中,利用絕對熒光定量方法探討了ATG5基因在太平洋鱈成魚各組織中的表達,并未采用現(xiàn)階段常用的相對定量方法 (2-△△CT方法[21-22]),絕對熒光定量是比較準確可靠的表達定量方法,以每ng中RNA含有的拷貝數作為基準進行比較,可以避免不同組織間內參的表達量不穩(wěn)定等問題,使定量結果更準確[23]。絕對熒光定量分析結果顯示,ATG5基因在各組織的表達量由高到低依次為肝、腎、脾、鰓、腦、肌肉,各組織表達量差異顯著。其中,ATG5在肝、脾、腎中的表達量最多,這與Pua等[24]推斷的肝、脾中ATG5含量較多相一致,也與Song等[25]認為腎骨髓中的ATG5含量較多一致,這可能是因為肝、脾、腎是ATG5參與免疫的主要組織,故表達量較高;ATG5在肌肉中表達量最低,表明ATG5在肌肉中參與免疫發(fā)生較少;ATG5在腦中的表達量較少,這與Hu等[26]報道的ATG5基因在斑馬魚成魚腦中表達量較高不同,這可能是隨著魚類的生長,ATG5的表達進行了轉移;ATG5在鰓中也有表達,但表達量不多。這表明ATG5在太平洋鱈成魚的免疫中參與位置廣泛,但有集中表達的地方。

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Cloning and expression of ATG5 gene in Pacific cod Gadusmacrocephalus

SUN Hang,MAO Ming-guang,JIANG Jie-lan,JIANG Zhi-qiang,LIXing,WEN Shi-hui
(Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

ATG5 as an abbreviation of autophagy related gene 5 is an importantgene for the formation of autophagosome,and plays a vital role in the maturation of autophagy regulation.In this study,a cDNA sequence of ATG5 was first cloned in Pacific cod Gadusmacrocephalus using gene cloning,and was found to be 895 bp encoding 275 amino acid residues with molecular weight of about32 200 in length with a whole open reading frame(ORF).The nucleotide sequence alignment showed that there was as high as similarity of87.27%in ATG5 among Pacific cod, Nile tilapia Oreochromis niloticus,and half-smooth tongue-sole Cynoglossus semilaev.The phylogenetic tree constructed by ATG5 nucleotide sequences of Pacific cod and some other animals reflected a genetic relationship which conformed to the viewpoint of traditional taxonomy.The amino acid sequence analysis revealed that ATG5 had high conservation.The expression of ATG5 in various tissues of Pacific cod using relative quantitative PCR and the absolute quantitative PCR showed that the higher expression levels of ATG5 mRNA were observed in liver,spleen and kidney than in other tissues,with 11.617 08 copies/ng in gill,20.449 25 copies/ng in kidney,19.706 87 copies/ ng in spleen,4.839 84 copies/ng in brain,27.434 97 copies/ng in liver,and 2.954 75 copies/ng inmuscle.The findings lay the foundation for further study of the phagocytosismechanism and provide basic data with understanding of immunemechanisms in Pacific cod.

Gadusmacrocephalus;ATG5 gene;cloning;absolute quantitative;expression analysis

S965.321

A

2014-12-12

國家 “863”計劃項目 (2012AA10A413);國家自然科學基金資助項目 (31302202);遼寧省教育廳科研項目 (L2013276):農業(yè)部海水增養(yǎng)殖重點實驗室開放課題 (2014-MSENC-KF-12)

孫航 (1990—),男,碩士研究生。E-mail:sunhang1016@163.com

姜志強 (1960—),男,教授。E-mail:zhqjing@dlou.edu.cn

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2015.05.005

2095-1388(2015)05-0478-06